高中生物-DNA的粗提取与鉴定

这是一篇关于DNA的粗提取与鉴定的思维导图，主要内容包括：常见问题，实验步骤，实验原理。

DNA的粗提取与鉴定

• 实验原理
  • DNA不溶于酒精，某些蛋白质溶于酒精
  • 在2mol/L的NaCl溶液中溶解度最高
  • 蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响
  • 大多数蛋白质不能忍受60－80°C的高温，而DNA在80°C以上才会变性
  • 洗涤剂可以溶解细胞的细胞膜，去除脂质和蛋白质,但对DNA没有影响
  • DNA遇二苯胺试剂（沸水浴）会呈现蓝色
• 实验步骤
  • 实验材料的选取：菜花、香蕉、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜；鱼卵、猪肝、鸡血、哺乳动物的红细胞；在液体培养基中培养的大肠杆菌
  • 目前常用材料：新鲜的鸡血（注意要加入柠檬酸钠，防止血液凝固）原因：鸡血细胞中DNA含量丰富，且材料易得。【盛放鸡血细胞液的容器最好是塑料器具，因为DNA容易被玻璃制品吸附，影响最终的DNA提取量】
  • 注意：滤纸会吸附DNA，所以用纱布或尼龙布
    • 植物细胞
      • 需要先用一定的洗涤剂溶解细胞膜。洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放（加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫）；食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解
      • 研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等
  • 除去滤液中的杂质
    • DNA的溶解性
    • DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性
      • 嫩肉粉原理：利用蛋白酶分解杂质蛋白，使提取的DNA与蛋白质分开
  • DNA的析出
    • 滤液+同体积、冷却的95%酒精，静置→白色丝状物→玻璃棒沿一个方向搅拌
      • 搅拌的目的(玻璃棒朝一个方向缓慢、均匀地搅拌)：卷起DNA丝状物，获取含杂质较少的DNA避免破坏DNA
      • 冷却的酒精溶液(体积分数95％)作用：
        • 抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解
        • 低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂
        • 抑制分子的运动，使DNA分子易形成沉淀析出
• 常见问题
  • 二苯胺试剂在使用上需要注意什么？
    • 现用现配，否则二苯胺会变成浅蓝色，影响鉴定效果
    • 有毒，使用时要注意
  • DNA和RNA在细胞中的分布实验中用的试剂是？
    • 甲基绿-吡罗红，不能用二苯胺，原因沸水浴会使细胞内成分位置移动
  • 可以单独用甲基绿鉴定某种物质是否是DNA吗？
    • 不可以，甲基绿同样会和RNA结合呈绿色
  • DNA的粗提取与鉴定实验中的“2、2、4、4、6”
    • 加蒸馏水 2次
      • 第一次：加到鸡血细胞中，使鸡血细胞吸水张破(细胞膜和核膜的破裂)，释放出DNA
      • 第二次：加到含有DNA的物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液，调节NaCl溶液物质的量浓度下降到0．14mol/L，使DNA黏稠物最大限度的析出
    • 析出DNA 2次
      • 第一次：用0.14 mol/L 的NaCI溶液析出DNA，过滤除去溶液中的杂质
      • 第二次：用冷却的95％的酒精，获得含杂质较少的DNA丝状物（利用DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精）
    • 用纱布过滤 4次
      • 过滤用蒸馏水稀释过的鸡血细胞液：获得含核物质的滤液
      • 过滤溶解有DNA的2mol/LNaCl溶液：得到含DNA的滤液
      • 过滤含粘稠物的0.14mol/LNaCl溶液：获取纱布上的DNA粘稠物
      • 过滤溶解有DNA的2mol/LNaCl溶液：得到含DNA的滤液
    • 用玻璃棒搅拌 6次
      • 第一次搅拌 加蒸馏水的鸡血细胞液：加速了鸡血细胞的破裂
      • 第二次搅拌 含DNA的2mol/LNaCl溶液的滤液：加速DNA溶解
      • 第三次搅拌 加蒸馏水至0.14mol/L的NaCl溶液：稀释NaCl溶液,析出DNA黏稠物
      • 第四次搅拌 含DNA（纱布上的粘稠物）的高浓度盐溶液：使DNA黏稠物充分溶解在2mol/LNaCl溶液中
      • 第五次搅拌 含DNA的体积分数为95%的酒精溶液：卷起DNA丝状物，提取含杂质较少的DNA
      • 第六次搅拌 含DNA白色丝状物的盐溶液：加速DNA水解
      • 注：第1次快速搅拌，后5次都是缓慢搅拌，防止DNA分子断裂