PCR技术与应用

这是一篇关于PCR技术与应用的思维导图，主要内容包括：PCR的应用，传统PCR结果分析，PCR引物设计原则，PCR的实验操作，PCR反应的体系。

PCR技术与应用

• PCR反应的体系
• PCR的实验操作
  • 设备及用具
    • PCR仪
      • 实质上是能够自动调控温度的仪器
    • 微量离心管
      • 一种薄壁塑料管，总容积为0.5mL
    • 微量移液器
      • 用于定量转移PCR配方中的液体，不同规格的移液器配套使用不同大小的枪头，每吸取一种试剂后，移液器上的一次性枪头都必须更换
• PCR引物设计原则
  • 设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和高效性
  • 限制条件
    • 引物长度要适宜
      • 一般，引物的长度为15-23bp，常用的长度为 18-21bp
      • 过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq 酶进行反应；过短特异性差
    • 引物GC含量要适宜
      • 3'端防止连续三个C或G；引物的GC含量一般为45-55%，过高或过低都不利于引发反应
    • 引物自身及引物之间不应存在互补序列
      • 碱基要随机分布，且引物自身和引物之间不能有连续4个碱基的互补。否则引物自身会折叠成发夹结构或二聚体，从而影响引物与模板的复性结合
    • 引物5'端可以修饰，3'端不可修饰
      • 引物的5'端可以修饰，而3'端不可修饰。引物5'端修饰包括：加酶切位点，加标记荧光，引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等
    • 退火温度要适宜
      • 退火温度高，扩增特异性强；退火温度低，扩增效率高
      • 一对引物的退火温度相差4℃～6℃不会影响PCR的产率
• 传统PCR结果分析
  • 对扩增后的DNA染色处理后凝胶电泳分离。DNA电泳是根据DNA分子大小来分离和识别DNA片段的技术。较小的DNA片段在凝胶中的移动相对容易，较大的DNA片段移动难
  • 缺点：只能作定性分析，不能准确定量。易造成污染出现假阳性，使其应用受到限制
• PCR的应用
  • 反向PCR测定未知DNA区域
  • PCR定点突变技术—重叠延伸PCR
  • PCR定点突变技术—大引物PCR
  • （实时）荧光定量PCR（（r）RT-PCR）
    • r代表实时（real-time），RT表示逆转录（reverse transcription）。在RT-PCR中，通过逆转录酶将RNA转化为cDNA，然后通过聚合酶链式反应扩增cDNA
    • 优点：早期诊断、灵敏度和特异性高，判断是否感染新冠病毒的直接接证据
  • 巢式PCR
  • 不对称PCR
  • 交错延伸PCR
    • 基本步骤
      • 变性模板链与引物结合
      • 短暂延伸形成小片段
      • 另一循环时，小片段与模板随机结合作为引物（template switching）并继续延伸
      • 重复上述过程直至全长基因形成即最终得到新组合的基因