实验室-WB实验步骤级原理思维导图

实验室——WB实验步骤级原理思维导图，主要包含准备、 电泳、 转膜、 封闭、 孵育、 显影等。

WB

• 准备
  • 样本：水浴加热，使之变性；溴酚蓝染色
  • 电泳液（PBS溶液）
  • 制胶（两个）
    • 下层胶（分离胶）
      • A液+B 液+过硫酸铵+TEMED，注入，去离子水/无水乙醇封装，等待凝固
    • 上层胶（浓缩胶）
      • A液+B液，注胶，插入梳子，带字一面朝外，等待凝固
• 电泳
  • 加蛋白
    • 拔出梳子，加蛋白marker 和 样本
  • 跑胶
    • 插电源：红对红、黑对黑
    • 浓缩胶：80V，30~60min， 分离胶：120V，60min
• 转膜
  • 低温进行，在转膜液中进行
  • 切胶，剪膜（甲醇激活）
  • 三明治结构
    • 1棉垫、3滤纸、胶、膜、3滤纸、1棉垫、
  • 转膜（黑对黑）：400mA 35min
• 封闭
  • 5%脱脂奶粉的TBST缓冲液
  • 将膜放入盒子中，倒入封闭液没过膜，摇床80r，1小时
• 孵育
  • 一抗
    • 4度，摇床上80r过夜
      • 回收一抗，-20°保存
      • TBST洗膜3次
  • 二抗
    • 摇床90转，孵育2小时
      • TBST洗膜3次
    • 酶标或同位素标
• 显影
  • 配制发光液（A液+B液）
  • 曝光
• 原理
  • SDS
    • 和蛋白质结合，使之带大量负电，消除了蛋白质的电荷差异，通电后，蛋白质向正极移动，且移动速度只与分子量有关，越大越慢越
  • TBST
    • TBST 即 Tris 盐缓冲液（TBS）加入了 Tween -20，是生物学中常使用的等渗缓冲盐溶液。 TBST 作为一种非离子型去污剂，有复性抗原的作用，可以用于免疫印迹（WB）、免疫荧光（IF）、免疫组化（IHC）和免疫细胞化学（IC）等试验中封闭液的配制、一抗二抗的配制、一抗二抗孵育后的洗涤等
  • 过硫酸铵：催化剂 TEMED：加速剂
  • 膜（硝酸纤维素[NC膜]or PVDF 膜）
    • 与蛋白质亲和力高
  • 甲醇
    • 使蛋白质和SDS分离
  • 封闭（5%脱脂奶粉的TBST缓冲液）
    • 封膜，以防止膜与一抗、二抗结合
  • 一抗
    • 与目标蛋白特异性结合
  • 洗膜
    • 洗去未结合的一抗
  • 二抗
    • 与一抗结合，带有辣根过氧化物酶
  • 发光液
    • 辣根过氧化物酶的底物，在其催化下发生发光反应
  • 定性
    • 根据条带的位置
  • 半定量
    • 条带的粗细