质粒试剂盒分类以及提取常见问题总结

质粒大中小提取试剂盒分类、质粒提取方式分类、质粒提取试剂盒各自优势、质粒提取过程中常见问题。质粒提取系列这部分展示了不同规模（小、中、大、超大）的质粒提取方法，涵盖了硅胶膜法、磁珠法、离子交换法等。硅胶膜法：一种常用的质粒提取方法，利用硅胶膜的特性吸附DNA，再通过特定的溶液将质粒DNA洗脱下来。提供了一个全面而详细的质粒提取指导，覆盖了从基础方法到特定应用场景下的解决方案，对于备考来说是非常有价值的参考资料。

质粒提取系列

• 质粒小提
  • 硅胶膜法
    • 常规小量提取
      • BW-PD1228(全能型质粒小提试剂盒）
      • BW-PD1211（质粒小提试剂盒）
      • BW-PD1213（质粒小量提取试剂盒）
      • BW-PD1218（快速质粒小量提取试剂盒）
      • BW-PD1812(96孔质粒提取试剂盒）
      • 常见问题
        • 质粒提取得率低
          • 原因1：样本拷贝数低
            • 不同质粒载体因拷贝数差异会造成产量有明显的波动。对于低拷贝质粒应加大菌液使用量，同时按照比例增加Buffer A1、Buffer B1和Buffer C1的用量。洗脱液使用前先放置65℃预热，以增加洗脱效率。低拷贝质粒例如：pET系列，pWE15，SuperCos，pBR322，pACYC及其衍生载体，pSC101及其衍生载体等
          • 原因2：Buffer B1析出，导致裂解能力降低
            • Buffer B1溶液温度低于15℃时，会有晶体析出，使用前需要放置37℃水浴锅加热溶解，呈现澄清透亮状态方可使用
          • 原因3:裂解时间过短，裂解不充分
            • 加入裂解液后，需要一定的时间进行裂解，一般时间控制再5min以内，当样本从浑浊样变成澄清，说明裂解完全。
          • 原因4：培养过程质粒丢失
            • 甘油菌菌种保存过程中存在质粒丢失现象，建议培养细菌前先划线或涂布平板活化菌种，以稳定产量
          • 原因5：培养时间过长，抗生素失效
            • 细菌的培养时间不要超过16 h，发生溶菌将降低质粒质量，最好控制在14小时
          • 原因6:宿主菌株差异性
            • 不同宿主对质粒产量也会产生影响。建议使用end A-大肠杆菌菌株，如DH5α、TOP10及XL10等
        • RNA污染
          • 原因1;RNAase失活或者活力下降
            • 已加入RNase A的Buffer A1长时间室温放置可能会出现酶活下降，使用后应及时放回4℃冰箱
          • 原因2：样本量过多，超过RNAase处理量
            • 由于菌体数量过多，导致Buffer A1中RNase A不足以消化菌体中的RNA，建议等比例增加Buffer A1用量或者减少菌液量
          • 原因3;醇类加入过多
            • 加入无水乙醇时请严格按照说明书操作，异丙醇加入实际上清体积的0.3倍。
        • 基因组污染
          • 原因1：裂解力度过大
            • 解时建议轻轻反转，避免裂解过度导致质粒与基因组断裂
          • 原因2：中和力度过大
            • 中和时不可使用振荡器震荡，因轻柔反转，中和后状态呈现豆花状，即中和完全
          • 原因3;因样本片段<2000KB，容易产生基因组
            • 中和过程中可以增加冰浴，降低基因组污染
        • 纯度低
          • 原因1：盐类残留
            • 用DNA wash Buffer再漂洗1次；建议沿吸附柱管壁四周加入，或加入后颠倒混匀2 - 3次，有助于减少盐离子残留
          • 原因2：乙醇残留
            • 空转过后，可以室温方式5min，让其醇类挥发
          • 原因2：蛋白污染
            • 原因1：未使用去蛋白试剂清洗
              • 建议使用去蛋白试剂Buffer KB进行洗涤
            • 原因2：样本量过多
              • 当样本量增加时候，请等比例放大去Buffer KB
    • 无内毒素小量提取
      • 内毒素水平1-10EU/ug
        • BW-PD1212(无内毒素质粒小量提取试剂盒）
        • BW-PD1222(无内毒素快速质粒小提试剂盒）
        • BW-PD1219(10分钟快速去内毒素质粒小提试剂盒）
        • BW-PD1818（过滤法无内毒素96孔质粒小量提取试剂盒）
        • 过滤法无内毒素96孔质粒小量提取试剂盒
        • 常见问题
          • 内毒素高
            • 原因1：加入 Buffer C1时候未中和完全
              • 加入后要充分混匀，内部无明显的局部阴影，并且过滤离心的上清无蛋白沉淀残留。
            • 原因2：样本量过多
              • 处理过量菌液，应该按照比例增加Buffer RET的用量
            • 原因3：Buffer RET未充分混匀
              • 加入Buffer RET 后应充分混匀，可增加上下颠倒次数至15次
      • 内毒素水平<0.1EU/ug
        • BW-PD1212(无内毒素质粒小量提取试剂盒）
          • Endoclean Buffer 过于粘稠不好取样
            • 为去除内毒素效果较好，再吸取该溶液时请轻轻使用移液枪进行吸取溶液，当溶液充满整个枪头时候再取出枪头。
          • 离心后不能将Endoclean Buffer与上清液分离
            • 离心温度不可低于23℃，离心时候请设置离心机稳定。
          • 内毒素含量超标
            • 原因1：上清中残留Endoclean Buffer
              • 在萃取完后，吸取上清时候请勿吸取Endoclean Buffer
            • 原因2：Endoclean Buffer与上清液未充分混合
              • 充分混合，混合完成后混合液呈现出粉色浑浊状态
            • 原因3：Endoclean Buffer冰浴时间过短
              • 建议放置冰中孵育10min以上
  • 磁珠法
    • 常规小量提取
      • BW-MPD2001(全自动质粒小量提取试剂盒）
        • 试剂盒搭配仪器型号
          • 全自动质粒小提系统（BEIWO SP-1604）
      • BW-MPD1211（质粒小提试剂盒I（磁珠法））
        • 小量
        • 试剂盒搭配仪器型号
          • Auto pure A32 &Auto pure A96
      • BW-MPD1213（质粒小量提取试剂盒II（磁珠法））
        • 小中量奥盛A24仪器
        • 试剂盒搭配试剂盒型号
          • Auto pure24
      • 常见问题
        • 磁珠残留
          • 提取完成后取出样本12000rpm 离心3min
        • 纯化低
          • 原因1：裂解充分
            • 样本量适中，裂解时间与混合时间充分
          • 原因2：洗涤残留盐类和蛋白
            • 增加最后一步洗涤溶液次数，再洗涤过程中可以增加洗涤震荡力度与混合时间
          • 原因3:乙醇挥发不彻底
            • 磁珠在晾干过程中保证充分晾干，建议增加晾干时间
        • 得率低
          • 原因1：裂解不充分
            • 在裂解过程中，Buffer B1的使用量不准确，建议使用对应量进行裂解，同时保证裂解时间与充分混匀
          • 原因1：样本拷贝数低
            • 不同质粒载体因拷贝数差异会造成产量有明显的波动。对于低拷贝质粒应加大菌液使用量，同时按照比例增加Buffer P1、Buffer P2和Buffer N3的用量。洗脱液应65℃预热，以增加洗脱效率。低拷贝质粒例如：pET系列，pWE15，SuperCos，pBR322，pACYC及其衍生载体，pSC101及其衍生载体等
          • 原因2：Buffer B1析出，导致裂解能力降低
            • Buffer B1溶液温度低于15℃时，会有晶体析出，使用前需要放置37℃水浴锅加热溶解，呈现澄清透亮状态方可使用
          • 原因3:裂解时间过短，裂解不充分
            • 加入裂解液后，需要一定的时间进行裂解，一般时间控制再5min以内，当样本从浑浊样变成澄清，说明裂解完全。
          • 原因4：培养过程质粒丢失
            • 甘油菌菌种保存过程中存在质粒丢失现象，建议培养细菌前先划线或涂布平板活化菌种，以稳定产量
          • 原因5：培养时间过长，抗生素失效
            • 细菌的培养时间不要超过16 h，发生溶菌将降低质粒质量，最好控制在13 - 15 h
          • 原因6:宿主菌株差异性
            • 不同宿主对质粒产量也会产生影响。建议使用end A-大肠杆菌菌株，如DH5α、TOP10及XL10等
          • 原因7:洗脱液使用不恰当
            • 建议使用试剂盒中的Elution Buffer ，若用ddH2O或其它洗脱液，确认洗脱液pH值在7.5 - 8.5之间。
    • 无内毒素小量提取
      • BW-MPD2101(全自动无内毒素质粒小量提取试剂盒）
        • 试剂盒搭配仪器型号
          • 全自动质粒小提系统（BEIWO SP-1604）
      • BW-MPD1220（无内毒素质粒小提试剂盒（磁珠法））
        • 试剂盒搭配仪器型号
          • Auto pure A32 &Auto pure A96
      • BW-MPD12221(无内毒素质粒小提试剂盒II（磁珠法））
        • 试剂盒搭配试剂盒型号
          • Auto pure24
      • 常见问题
        • 内毒素高
          • 原因1：加入 Buffer C1时候未中和完全
            • 加入后要充分混匀，内部无明显的局部阴影，上清保证无明显的白色沉淀。
          • 原因2：样本量过多
            • 处理过量菌液，应该按照比例增加去内毒素溶液用量
          • 原因3：Buffer RET未充分混匀
            • 加入Buffer RET 后应充分混匀，可增加混合的幅度与混合的时间
• 质粒中提
  • 硅胶膜法
    • 常规中量质粒提取试剂盒
      • BW-PD1411(质粒中量提取试剂盒1)
        • 60分钟、15-50ml菌、得率200ug
      • BW-PD1413(过滤法质粒中量提取试剂盒1）
        • 45分钟、50ml菌、得率250ug
      • BW-PD1414（过滤法质粒中量提取试剂盒2）
        • 45分钟、100ml菌、得率450ug
      • BW-PD1412（质粒中量提取试剂盒2）
        • 60分钟、50-100ml菌、得率500ug
      • BW-PD1468（快速质粒中量提取试剂盒）
        • 25分钟，30-80ml菌、得率500ug
    • 去内毒素(1-10EU/ug)中量提取试剂盒
      • PD2468(快速无内毒素质粒中量提取试剂盒）
        • 25分钟、15-50ml、得率200ug
      • BW-PD1422(过滤法无内毒素快速质粒中量提取试剂盒）
        • 45分钟、15-50ml、得率200ug
      • BW-PD1420（无内毒素快速质粒中量提取试剂盒1）
        • 60分钟、15-50ml、得率200ug
      • BW-PD1424（过滤法无内毒素快速质粒中量提取试剂盒2）
        • 40分钟、50-100ml、得率500ug
    • 去内毒素（<0.1EU/ug）中量提取试剂盒
      • PD1416(过滤法无内毒素质粒中量提取试剂盒）
        • 45分钟、15-50ml、得率200ug
      • PD1415（无内毒素质粒中量提取试剂盒）
        • 60分钟、15-50ml、得率200ug
      • BW-PD1418(过滤法无内毒素质粒中量提取试剂盒2）
        • 45分钟、50-100ml、得率400ug
      • BW-PD1417(无内毒素质粒中量提取试剂盒2）
        • 60分钟、50-100ml、得率400ug
  • 磁珠法
    • BW-MPD1420(无内毒素快速质粒中量提取试剂盒）
  • 离子交换法
    • BW-PD5002(离子交换质粒中提试剂盒）
      • 常见问题
        • 得率低
          • 原因1：离子交换柱未进行前处理，即未使用10倍数柱体积的灭菌水清洗
          • 原因2：离子交换柱未使用BEQ Buffer平衡柱子，或因使用Buffer BEQ后未盖紧盖子导致其挥发影响溶液效果。
          • 原因3：使用蠕动泵或者负压装置导致上清过柱太快，结合效率低。
          • 原因4：洗脱液Buffer BEL使用量不充分，导致洗脱不完全
          • 原因5：离心法沉淀的离心力（14000rpm）、温度（4℃）、时间（30min）不够，导致未能充分沉淀。
          • 原因6：操作过程中将质粒倒出
        • 内毒素含量高
          • 原因1:样本量过多
            • 处理样本量过多，等按照等比例增加其Buffer BWHⅠ的用量
          • 原因2：Buffer BWHⅠ加入量过少
            • 如内毒素过高，可以增加Buffer BWHⅠ用量
          • 原因3：引入外源内毒素
            • 操作过程中请使用无热源枪头与EP管
          • 原因4：样本培养时间过长
            • 细菌的培养时间不要超过16 h，发生溶菌将降低质粒质量，最好控制在14小时，如培养时间过长，可以在原试剂盒用量上再增加 Buffer BWHⅠ量。
        • 纯度低
          • 原因1：裂解充分
            • 样本量适中，裂解时间与混合时间充分
          • 原因2：洗涤残留盐类和蛋白
            • 醇沉淀后，使用70%乙醇洗涤时候，请进行充分的漂洗，管壁的部分请加入时候沿着管壁进行冲洗
          • 原因3:乙醇挥发不彻底
            • 在晾干过程中可放入烘箱中，或者通风橱晾干，保证乙醇全部挥发
        • 离子交换柱堵塞
          • 原因1：再生不完全
            • 离子交换柱如重复使用，再生建议过夜处理，加入1M氢氧化钠
          • 原因2：预处理将离子交换柱处理太干
            • 柱预处理时候使用抽滤泵，导致柱子抽滤太干，下一步加入溶液时候很难流川，建议已处理如使用泵抽不要将柱子抽太干，保证其上表面依然有液体，同时加入溶液可以自行重力自滴。
• 质粒大提
  • 硅胶膜法
    • 常规质粒大量提取
      • BW-PD1511(质粒大量提取试剂盒）
        • 60分钟、150-200ml菌、1.5mg
      • BW-PD1512(过滤法质粒大量提取试剂盒）
        • 45分钟、150-200ml菌、得率1.5mg
      • BPD1568(快速质粒大量提取试剂盒）
    • 无内毒素质粒大量提取（1-10EU/ug）
      • PD2568(快速无内毒素质粒大量提取试剂盒）
        • 40分钟、100-200ml菌、得率1mg
      • BW-PD1522(过滤法无内毒素快速质粒大题试剂盒）
        • 45分钟、150-200ml菌、得率1.5mg
      • BW-PD1520(无内毒素质粒大量提取试剂盒（柱式法））
        • 60分钟、150-200ml菌、得率1.5mg
    • 无内毒素质粒大量提取(0.1EU/ug)
      • BW-PD1514(无内毒素质粒大量提取试剂盒）
        • 60分钟、150-200ml菌、得率1mg
      • BW-PD1515（过滤法无内毒素质粒大量提取试剂盒）
        • 45分钟、100-200ml菌、得率1mg
      • BW-PD1516（高纯度无内毒素质粒大量提取试剂盒）
        • 1.5h、100-200ml菌、得率1-5mg
  • 磁珠法
    • 常规质粒大量提取
      • BW-MPD1511(质粒大量提取试剂盒（磁珠法））
      • BW-MPD1511-A24（质粒大量提取试剂盒（磁珠法））24通道预装板
    • 无内毒素质粒大量提取（1-10EU/ug）
      • BW-MPD1520(无内毒素质粒大量提取试剂盒(磁珠法））
      • BW-MPD1520-A24(无内毒素质粒大量提取试剂盒(磁珠法））24通道预装板
  • 离子交换法
    • BW-PD5003（无内毒素质粒超大量提取试剂盒）
    • BW-PD5001（全自动无内毒素质粒提取试剂盒）
      • 可搭配仪器BEIWO CB-12/BEIWO CBE24350
• 质粒超大提
  • 硅胶膜法
    • 载量3mg
      • PD1568(快速质粒大量提取试剂盒(Mega 3）
    • 载量6mg
      • PD1611(质粒超大量提取试剂盒（Mega 6）
    • 载量10mg
      • PD1614(质粒超大量提取试剂盒（Maga10）
    • 常看问题
      • 得率低
        • 可以在上清过过滤杯时控制流程速度或者将上清重复2-3次上样
      • 纯度低
        • 原因1：盐类残留
          • 用DNA wash Buffer再漂洗1次；建议沿吸附柱管壁四周加入，或加入后颠倒混匀2 - 3次，有助于减少盐离子残留
        • 原因2：乙醇残留
          • 放入50℃烘箱中烘干，让其醇类挥发
        • 原因2：蛋白污染
          • 原因1：未使用去蛋白试剂清洗
            • 建议使用去蛋白试剂Buffer KB进行洗涤
          • 原因2：样本量过多
            • 当样本量增加时候，请等比例放大去Buffer KB
• 从内源核酸酶菌种中提取质粒
  • HP质粒小量提取
    • BW-PD1711(HP质粒小量提取试剂盒）
  • HP质粒中量提取
    • BW-PD1712（HP质粒中量提取试剂盒）
  • HP质粒大量提取
    • BW-PD1713（HP质粒大量提取试剂盒）
  • 常见问题
    • 提取质粒跑电泳图有拖带
      • 含有endA+含有阳性菌，能够产生核酸酶，溶液降解质粒，所以遇到该系列菌种建议使用Buffer KB ,如已使用但还是出现，建议多加一次Buffer KB洗涤
    • 提取质粒放置一段时间有降解
      • 含有的核酸酶，建议培养的样本时间不易过长，在14小时内，如增加样本提取量，同时也要增加Buffer KB使用量或者重复2次洗涤。
• 大型质粒提取
  • 小量提取
    • 大型质粒（BAC/PAC）质粒提取试剂盒
      • 常见问题
        • 得率低
          • 原因1：操作手法与幅度过于大
            • 操作时候建议还是手法轻柔，并且中和过后的样本尽量放置在冰面上操作。
          • 原因2:质粒提取过程中降解
            • 提取过程中因片段较大较容易断裂，所以在操作提取时温度尽量偏低，纯化后端在冰面上操作，可以有效减少质粒断裂
        • 提取样本放置一段时间有降解
          • 保存不当，建议保存放置-20℃或-80℃保存
• 酵母质粒提取
  • 酵母质粒小量提取试剂盒
  • 96孔酵母质粒提取试剂盒
  • 过滤法96孔酵母质粒提取试剂盒
  • 常见问题
    • 得率低
      • 原因1：裂解不充分，可以增加Buffer SE（含有Lyticase solution）孵育时间，建议30min以上。
      • 原因2：样本不新鲜
        • 建议使用新鲜样本提取
      • 原因3:玻璃珠研磨不从分，建议该步骤可以反复冻融。
    • 纯度低
      • 原因1:样本裂解不充分
        • 样本裂解不充分，有大量的样本未裂解开导致纯度差
      • 原因2：盐类蛋白残留
        • 使用 Buffer KB与DNA wash Buffer洗涤时，注意管壁清洗，同时如蛋白残留过多可以增加 Buffer KB再洗涤一次，如盐类一步残留可以再增加DNA wash Buffer洗涤
      • 原因3：醇类残留
        • 空转完成后可以室温静止5min有利于醇类挥发
• 浮动主题
• 浮动主题
• 浮动主题