导图社区 通过整合单细胞转录组学和质谱流式细胞术来定义类风湿关节炎关节
文献阅读笔记，解离用于质谱流式细胞术与RNA测序的组织解离、用于RNA-seq细胞的分选、滑膜的组织学评估与质量控制。
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通过整合单细胞转录组学和质谱流式细胞术来定义类风湿关节炎关节滑膜组织中的炎症细胞状态。
研究设计和患者招募
患者
大于18岁
至少有一个关节发炎
滑膜组织获得
关节置换手术
超声活检
滑膜的组织学评估与质量控制
组织学分析
基于白细胞浸润的组织样本分类
通过计数细胞核来估计细胞数
同一标本多部位分析减轻样本变异性
分子分析生成汇总数据
评估滑膜炎分级
krenn衬里评分
炎症评分
解离用于质谱流式细胞术与RNA测序的组织解离
机械和酶促方法分离
台盼蓝染液进行细胞数量及活力评估
分配样本
标本活滑膜细胞超过200000
百分之五十用于质谱流式细胞术分析
百分之五十用于RNA-seq
标本活滑膜细胞不足200000
全部用于RNA-seq分析
用于RNA-seq细胞的分选
用抗 CD45（HI30）、CD90（5E10）、足细胞蛋白（NZ1.3）、CD3（UCHT1）、CD19（HIB19）、CD14（M5E2）、CD34（4H11）、CD4（RPA-T4）、CD8（SK1）、CD31（WM59）、CD27（M-T271）、CD235a（KC16）的抗体对分解的滑膜细胞染色30min
分出1000 个有活力的细胞（PI-）
T 细胞（CD45+CD3+，CD14-）
B 细胞（CD45+、CD3−、CD14−、CD19+）
单核细胞（CD45+CD3-，CD14+）
滑膜成纤维细胞（CD45、CD31−、PDPN+）
通过流式细胞仪分选直接收集在 RLT 缓冲液中用于批量 RNA 测序
每个样品各类型细胞选择少于144个用于单细胞RNA测序
用于验证大量 RNA 测序实验的流式分选
使用抗体组合定义各细胞亚群
成纤维细胞：CD90 （5E10）、podoplanin （NZ1.3）、HLA-DR （G46-6）
B 细胞亚群：HLA-DR （G46-6）、CD11c （3.9）、CD19 （SJ25C1）、CD27 （M-T271）、IgD （IA6-2）、CD3 （UCHT1）、CD14 （M5E2）、CD38 （HIT2）
单核细胞亚群：CD14-BV421 （M5E2）、CD38-APC （HB-7） 、CD11c-PECy7 （B-ly6）
从组织中分选表达特定基因的细胞群体
从CD90（5E10）、HLA - DR（G46 - 6）角度分选
从4 个 OA 样本中分选了 THY1 - DR-群体
从 4 个 OA 和 6 个 RA 样本中分选了 THY1 + DR -群体
从 6 个 RA 样本中分选了 THY1 + DR +群体
从细胞类型角度分选
单核细胞
从 2 个 RA 样本中分选了 CD14 + CD11c⁺⁺⁺ CD38⁺⁺⁺群体
从 2 个 OA 样本中分选了 CD14 + CD11c + CD38 群体
B 细胞
从 6 个 RA 样本中分选了 CD11c⁻ IgGD⁻ CD27⁺群体
从 3 个 RA 样本中分选了 CD11c CD11c⁻ IgG⁺ CD27⁻群体
从 3 个 RA 样本中分选了 CD19 + CD11c +
从 3 个 RA 样本中分选了浆细胞
使用LDA（线性判别分析）建立模型，对大量RNA测序的高纬度数据进行降维处理以便于在单细胞RNA测序的数据之中进行拟合，用以发现新的细胞
使用每个簇的前 500 个标记基因在 scRNA - seq 簇上训练 LDA 模型，这些标记基因能够在一定程度上代表不同的细胞簇特征
应用 LDA 模型对每个批量分选细胞的样本进行分类时，估计每个样本的最大后验概率。对于每个scRNA-seq样本，根据其特征（由 LDA 模型投影后的特征表示）和基于训练数据得到的先验知识（LDA 模型的参数分布），计算它属于各个类别（不同的细胞簇类别）的后验概率，并将其分类到后验概率最大的类别中
细胞群疾病关联试验
标记基因的选择标准
评估这些标记基因在 scRNA - seq 和批量 RNA - seq 数据集中是否在相同方向上差异表达。如果在两种数据集中，某个标记基因在 RA 样本中都是上调或者都是下调，那么就符合在相同方向上差异表达的情况。
MASC（一种单细胞关联方法）
测试病例对照状态（即 RA 和 OA 的区分）是否会影响单个细胞在多个细胞亚群中的成员身份。
