分化流程

人多能干细胞分化成黑色素细胞的过程，包括细胞培养，细胞传代等多种重要步骤类型，方法适用任何实验，放心复制。

• 十、黑色素细胞的保存（30min）
  • 1、分离黑色素细胞
    • 根据黑色素细胞传代的1-3步
  • 2、测定活细胞密度。在4℃下300×g离心5min，弃上清
  • 3、用合适的冷冻培养基（90%FBS加上10%DMSO）的体积重悬沉淀，将细胞悬液等分到冷冻瓶中
  • 4、将小瓶放入梯度冷冻箱中，并储存在-80℃
  • 5、24h后，将冷冻细胞转移到液氮中
• 分化流程
• 黑色素细胞的分化（5-6 weeks）
• 九、黑色素细胞的传代（30min）
  • 1、单细胞分离前1h，准备好涂有fibronectin的板.当细胞达到90%融合的时候，吸出并丢弃培养基，轻轻地用DPBS清洗细胞
  • 2、对于60mm培养盘，加600μLTrypLE Express Enzyme,确保完全覆盖在细胞上。在15-25℃下孵育1-2min，使用显微镜不断看细胞形态
  • 3、当黑色素细胞形成一个圆形，轻轻地敲击培养瓶以分离细胞，加2mlDMEM（low glucose）去稀释酶，避免吸到底部（底部可能有碎片），将全部上清转移到15ml的圆锥孔中。用2ml新的DMEM去洗培养盘以收集剩余的细胞，加到相同的圆锥孔中
  • 4、在4℃下300×g离心5min，弃上清。用黑色素分化培养基（加0.5%FBS但不含TPA）重悬沉淀
  • 5、进行细胞计数，将黑色素细胞以2×104/cm2的密度转移到新的准备好的涂有fibronectin的培养板上
• 八、单细胞分离（30min）
  • 1、在单细胞分离1h之前，准备涂有fibronectin的板
  • 2、吸出并丢弃培养基，用DPBS轻轻地洗细胞后丢弃。对于六孔板的每个孔，加600μLTrypLE Express Enzyme,确保完全覆盖在培养基上
  • 3、在15-25℃下孵育2-3min，在显微镜下经常观察。
  • 4、当分化的细胞变圆时，加2mlDMEM(low glucose)去稀释酶，轻轻吹吸细胞，将全部上清转移到15ml的圆锥管中。用另外2ml的DMEM清洗板，将残余的细胞加入相同的圆锥管中，静置2-3min，使聚集物沉淀
  • 5、小心地收集圆锥管上部的上清，在4℃300×g离心5分钟。弃掉上清，用黑色素细胞分化培养基（加0.5%FBS，无TPA）重悬颗粒
  • 6、细胞计数，将黑色素细胞按照2×104/cm2的密度放在涂有fibronectin的板上
    • 每2-3天更换培养基，当细胞融合度达到90%时传代
• 七、早期分化阶段（3 weeks）
  • 1、选择已经分化好的EB，将其转移到15ml的圆锥管中，静置2-3min，使聚集物沉淀，小心地去除上清
  • 2、在黑色素细胞分化培养基中重悬EBs,将其转移到低吸附的各个六孔板中。（对于6孔板的每个孔，20个EBs是接受的）
    • 每2-3天半换培养基
  • 3、两周后，收集分化好的EBs，并将它们转移到涂有fibronectin的板中。（对于六孔板的每个孔，10个EBs是接受的）
  • 4、使用黑色素细胞分化培养基继续分化7天
    • 每2-3天半换培养基
• 一、解冻小鼠成纤维细胞(50min)
  • 60mm dish
  • 37℃孵育30min
  • 吸出gelatin并丢弃
  • 3、添加5ml DMEM(high glucose)&10%FBS
  • 4、37℃孵育12-24h
  • 细胞密度至少达到70%-80%融合
• EB的生成（1 week）
• 六、使用单细胞形成EB（60min）
  • 1、吸出培养在无饲养层条件下的iPSCs，用DMEM/F12清洗细胞并丢弃
  • 2、在六孔板的每个孔中加入600μL的ACCUTASEÔ
  • 3、在15-25℃下孵育4-6min，经常在显微镜下观察细胞形态
  • 4、当细胞边缘变圆的时候，去除ACCUTASEÔ
  • 5、加2ml的DMEM/F12，轻轻吹吸细胞，使它们分离成单细胞
  • 6、将全部悬浮液转移到15ml 圆锥管中，用另外2ml的DMEM/F12收集剩余的悬浮液，再加到相同的圆锥管中
  • 7、在4℃下300×g离心5min，弃上清
  • 8、用1mlAggreWell EB形成培养基垂悬颗粒
  • 9、进行细胞计数，将2.5-5×105个细胞放到ElplasiaTM plate (24-well)的每个孔中，加入额外的培养基直到体积为2ml，最后加入Y-27632到最后的体积为10μL，确保细胞均匀分布
  • 10、在37℃孵育器下培养
  • 11、24h之后，轻轻地吹吸ElplasiaÔ板的底部，是聚集物漂浮
  • 12、收集聚集物溶液并转移到15ml的圆锥管中，让圆锥管放置2-3min，使聚集物沉淀
  • 13、小心地吸出上清液，去除Y-27632
  • 14、用新的AggreWell EB形成培养基轻轻地垂悬聚集物，并将它们转移到每个含有2ml超低附着的板上
    • 每天更换培养基
• iPSC准备（2 weeks）
• 五、使用聚集物形成EB（30min）
  • 1、将基于MEF条件培养的iPSCs分离成小的聚集物
    • 按照第三步iPSCs传代1~9步进行 注意：不要把iPSCs分离成太小的聚集物或单细胞
  • 2、弃上清，加2mlhES培养基（不含有bFGF），轻轻垂悬
  • 3、将聚集物转移到超低附着的培养板上，加Y-27632定容到10μL
  • 4、24h后，选择聚集物，将它们转移到15ml的圆锥管中
  • 5、在15-25℃ 200×g下离心30s去沉淀聚集物
  • 6、抽出上清，以去除Y-27632
  • 7、用新的hES培养基（不含bFGF）小心垂悬聚集物，将它们转移到含有2ml培养基的超低附着的孔中
    • 每天更换培养基
• 四、iPSCs传代（Feeder-Free Condition）（60min）
  • 1、准备涂有明胶的板
  • 2、弃去培养基溶液，用2ml提前冷好的DMEM/F12培养基清洗
  • 3、加600μL的ReLeSR，确保全部覆盖在培养基里面，1min后去除
  • 4、在15-25℃下孵育并观察
  • 5、在5-8分钟后，如果细胞间有明显的裂缝，则用力敲击盘子的一侧
  • 6、加2ml mTeSR1培养基到孔中，轻轻吹吸，使大的聚集物分离成小块
  • 7、吸取上清到涂有明胶的孔板中（按一定比例），添加额外的培养基使每个孔达到2ml
  • 8、在37℃孵育器中培养和摇摆
    • 每天更换培养基
• 三、iPSCs传代(MEF-Based Conditions)(40 min)
  • 1、准备mitomycin C–treated MEFs
    • 参考二、的第1步
  • 2、当iPSCs大约0.8-1mm时，弃去培养基溶液
  • 3、用4mlDMEM/F12洗，洗完后丢弃
  • 4、加700μL解离液，在15-25℃下孵育
  • 5、当iPSCs克隆边缘卷曲模糊时，弃去解离液
  • 6、用提前冷好的DMEM/F12洗两次后弃去
  • 7、加4mlDMEM/F12到培养基中，轻轻吹吸，把菌落分成小块
    • 不要用力过猛，避免将iPSCs分成单个细胞
  • 8、将细胞悬液转移到15ml圆锥管中，用4mlDMEM/F12加入培养皿中，以收集残余的菌块
  • 9、在4℃下200×g离心
  • 10、弃去上清，加hES培养基后垂悬细胞
  • 11、按比例分离细胞悬液到步骤1准备好的培养皿中
  • 12、在37℃，5%CO2加湿培养箱中摇和培养
• 1、2ml 0.1% gelatin
• 2、mitomycin C-inactivated MEFs
• 二、解冻iPSCs(30min)
  • 1、准备mitomycin C–treated MEFs
    • 1、参考一步骤中MEFs的处理 2、用5ml提前热好的DMEM洗MEFs以去除FBS，之后去掉DMEM； 3、在每个60 mm的培养皿中加入4 mL的hES培养基，然后返回培养箱。
  • 2、将iPSCs从液氮中拿出快速放到37℃的水浴锅中
  • 3、垂悬后放入15ml圆锥管+5mlDMEM/F12培养基
    • 再加1mlDMEM/F12培养基到冷冻管中，收集残余的细胞，加入到相同的圆锥管中
  • 4、在4℃下200× g离心5min
  • 5、去上清，+1mlhES后轻轻地垂悬
  • 6、将细胞垂悬液加入到第一步的培养皿中
  • 7、加入Y-27632并定容至10 μM
  • 8、37℃孵育
    • 每天更换（hES培养基）

中心主题

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