环境毒理学常用实验方法

这是一篇关于环境毒理学常用实验方法的思维导图，主要内容包括：急性毒性实验：急性毒性实验是给动物一次或24h内多次染毒的实验。蓄积毒性实验，亚慢性和慢性毒性实验，致突变试验，致畸试验，致癌试验。

环境毒理学常用实验方法

• 急性毒性实验：急性毒性实验是给动物一次或24h内多次染毒的实验。
  • 目的
    • 受试物毒作用的表现和性质；剂量-反应研究；确定毒作用的靶器官；确定损害可逆性。
  • 分类
    • 哺乳动物毒性实验
      • 一般选用小鼠和大鼠，经皮L50可用兔和豚鼠。
      • 急性阈剂量是一次染毒引起最低程度损害的最小剂量。
      • 试验方法
        • 游泳实验
        • 刺激阈实验
        • 局部作用实验
          • 急性皮肤刺激/腐蚀实验
          • 急性眼睛刺激/腐蚀实验
            • 用荧光素钠检查角膜损害,用裂隙灯检查角膜透明度和虹膜纹理改变。
    • 水生动物毒性实验
      • 鱼类毒性实验
        • 短期实验多采用青鱼草鱼鲢鱼及鳙鱼，长期试验采用金鱼 最常用斑马鱼
        • 半数耐受浓度（TLM)
      • 藻类急性毒性实验
        • 测试指标：光密度、细胞数、叶绿素含量及细胞干重。
    • 发光细菌生物毒性实验
      • 原理：发光细菌在干净水体中发光恒定，当受到污染物影响时，发光受抑制，受抑制的程度与水体中毒物的总体浓度及毒性大小有关。故用发光光度计测定其发光强度，即可评估该水样的毒性。
    • 蚯蚓急性毒性实验
      • 蚯蚓是土壤中生物量最大的动物类群。蚯蚓比其他土壤动物更为敏感。
      • 分类
        • 滤纸接触法毒性实验 ：将蚯蚓与湿润的滤纸上的受试动物进行接触，通过测定二十四时及48时蚯蚓死亡率，测定土壤中受食物对蚯蚓的潜在影响，并为进一步的毒性实验提供数据基础。 人工土壤实验：将蚯蚓置于不同浓度受试物的人工土壤中饲养七天和14天，观察蚯蚓死亡率。
• 蓄积毒性实验
  • 基本概念
    • 低于中毒阈剂量的外来化合物，反复多次与机体持续接触，经一定时间后，使得机体出现明显的中毒表现，称为蓄积毒性作用。
    • 蓄积作用分类
      • 环境污染物不断进入其体内，其吸收量大于排出量，使其在体内的量逐渐积累增多。此种量的蓄积称为物质蓄积。
      • 不断进入机体内的环境污染物反复作用机体，引起机体一定结构或功能的变化，并逐渐累积加重，最后导致出现损害作用，称为功能蓄积。
  • 试验方法
    • 蓄积系数法：分次给受试物后引起50%受试动物出现某种毒效应的总剂量与一次给受试物后引起50%受试动物出现同一毒效应的剂量的比值。
      • 比值越小，蓄积作用越强。
      • 分类：固定剂量每天连续染毒法、剂量定期递增染毒法、剂量固定的二十天蓄积法。
      • K＜1高度蓄积 1-3明显蓄积 3-5中度蓄积 K＞5轻度蓄积
    • 生物半减期法：用动物动力学原理描述化学毒物在其体内的蓄积作用， 生物半减期越长的物质，蓄积作用可能性越大。
• 亚慢性和慢性毒性实验
  • 亚慢性毒性实验
    • 为进一步确定受试物的主要毒作用、靶器官和最大无作用剂量或中毒阈剂量做出初步估计。
    • 实验动物：健康、年幼的动物。 小鼠体重为14-17克，大鼠体重50-80克， 家兔和猫体重1-2千克，狗体重5-8千克，至少三个剂量组和一个对照组。 染毒剂量：适宜的剂量为高剂量组能引起明显中毒反应，但不引起很多动物死亡。低剂量组不引起任何中毒反应，介于两者之间的为中间剂量组。 实验期限：大鼠可90天，较大的动物4-6个月。 观察指标：一般综合指标。：观察动物的一般活动症状和死亡情况，每周称重一次，记录饲料或饮水量，计算生长率，计算脏器湿重与单位体重的比值（脏器系数）。 血液及生化检验： 血红蛋白、红细胞数、白细胞数、血小板数、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、血清尿素氮等。
  • 慢性毒性实验
    • 以低剂量外来化合物长期与实验动物接触，观察其对实验动物所产生的生物学效应的实验。为制定人体每日允许摄入量，提供毒理学依据，确定最大无作用剂量。
    • 实验动物：小鼠10-12克，大鼠 50-70克，雌雄各半。 观察指标：在实验的头三个月每周称重一次，4-6个月期间每两周称重一次，以后的每四周称重一次。
• 致突变试验
  • 基本概念
    • 致突变作用
      • 基因突变：DNA在分子水平上发生碱基对组成或排列顺序的改变。
        • 碱基置换
          • 转移、颠换
        • 移码突变
      • 染色体畸变：当细胞中的染色体受到化学致突变物作用后，发生了较严重的损伤或损坏，以致出现了可用显微镜直接观察到的结构和数目的改变。
        • 染色体结构异常
          • 染色体型畸变（裂隙、断裂、缺失、倒位、易位、重排、重复、插入）
          • 染色单体型畸变
        • 染色体数目异常
    • 致突变作用后果
      • 体细胞突变
      • 生殖细胞突变
        • 显性致死突变、隐形致死突变、存活突变
  • 常用的致突变实验方法
    • 体外基因突变试验
      • 鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验法（Ames实验）
        • 利用一种突变型微生物菌株与被检化学物质接触，如该化学物具有致突变性，则可使突变性微生物发生回复突变，重新成长为野生型微生物。
      • 哺乳动物体细胞株突变实验
        • V79细胞株和CHO细胞株都类似成纤维细胞，他们缺乏利用嘌呤碱的一种酶，即次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（HGPRT)。
    • 细胞遗传学实验
      • 染色体畸变试验、微核试验
    • 体内基因突变试验：显性致死突变试验、果蝇伴性隐性致死实验
    • DNA损伤实验：姐妹染色单体交换实验、程序外DNA合成实验
• 致畸试验
  • 基本概念
    • 致畸物通过母体作用于胚胎而引起胎儿畸形的现象称为致畸作用。
    • 致畸作用的特点
      • 胚胎与致畸物发生接触时，胚胎所处发育阶段不同而呈现不同的敏感性；种属差异在致畸作用中较为明显，不同种系的动物显出不同的敏感性。
    • 化学致畸作用机理
      • 突变引起胚胎发育异常；对细胞的生长分化较为重要的酶类受到抑制；母体正常代谢过程被破坏，使子代细胞在生物合成过程中缺乏必需的物质，影响胚胎正常发育，以致出现生长迟缓及畸形；细胞分裂过程的障碍。
  • 试验方法
    • 动物选择：大鼠小鼠和家兔，其中大鼠为首选动物，因而最常用。
    • 剂量分组：一般以LD50的1/3到1/2为最高剂量组，LD50的1/30到100/1为低剂量组。 如采用鼠类为实验动物，每组不少于15到20只，家兔7到8只。
  • 致畸作用的评价
    • 1.实验结果中出现的畸形率高低，需从出现畸形的孕仔率、胎仔发生畸形率、单项畸形率、总畸形率等多方面进行统计综合分析。 2.同种动物重复试验和多种动物试验结果的一致性，对受试物的致畸作用有助于做出比较可靠的结论。 3.生物正常情况下也有自然的变异 4.受试物的致畸作用，也同其他效应一样，动物的种属甚至品系间也存在差异，因此不能根据一种动物具有致畸性而简单的推论对人类一定具有致畸性。
• 致癌试验
  • 基本概念
    • 化学致癌作用：指化学物质引起肿瘤的过程。
    • 细胞癌变学说
      • 体细胞突变学说：致癌因素 包括化学、物理、生物因素作用于体细胞的遗传物质DNA，使其发生突变，结果是使细胞的功能发生异常改变而致癌，以及癌变形成的基础是体细胞发生突变。
      • 分化障碍学说
      • 癌基因学说
    • 癌变过程
      • 引发阶段、促长阶段、浸润和转移阶段
  • 试验方法
    • 短期筛检方法
    • 长期动物诱癌试验
      • 试验动物及饲料要求：选用抗病力强、容易饲养、肿瘤自发率低，对受试物敏感的动物。首选动物为刚断乳或6-8周龄小鼠和大鼠。
      • 结果判断
        • 肿瘤只发生在受试组动物，对照组无肿瘤，或受试组出现对照组没有的肿瘤类型。 受试组与对照组均发生肿瘤，但受试组发生率高。 受试组的平均肿瘤数高于对照组。 受试组与对照组的肿瘤发生率虽无显著差异，但受试组肿瘤发生的潜伏期短。