小鼠脑组织石蜡切片

这是一篇关于小鼠脑组织石蜡切片的思维导图，主要内容包括：取材与固定（最关键的一步），脱水、透明与浸蜡，包埋，切片，脱蜡、复水与染色（以HE染色为例），封片与观察，关键注意事项，总结。

小鼠脑组织石蜡切片

• 取材与固定（最关键的一步）
  • 目标
    • 在动物死亡后迅速终止细胞自溶、保存组织原有形态结构
  • 方法
    • 灌注固定（强烈推荐，可获得最佳固定效果）
      • 麻醉：使用过量麻醉剂（如戊巴比妥钠/三溴乙醇0.3ml）深度麻醉小鼠
      • 开胸：将小鼠仰卧位固定，快速剪开胸腔，暴露心脏
      • 灌注
        • 用输液针（或钝头注射针）从左心室插入主动脉，同时剪开右心耳
        • 快速灌注约20-50 mL 生理盐水（或PBS），直至肝脏变白、右心房流出液体变清。目的是冲净血液
        • 改为灌注 4% 多聚甲醛磷酸缓冲液（PFA） 或 10% 中性福尔林，约50-100 mL。动物会迅速僵硬，尾巴翘起
      • 取脑：灌注后，断头，用剪刀从枕骨大孔开始，小心剪开颅骨，取出完整脑组织
      • 后固定： 将取出的脑组织立即放入足量的新鲜4% PFA中，在4°C冰箱内固定6-24小时（时间过长会硬化组织）。固定后，用PBS漂洗数次，以去除固定液
    • 直接浸泡固定（如无法灌注）
      • 快速断头取脑，立即将完整脑组织投入足量的4% PFA中
      • 在4°C下固定24-48小时（因组织较厚，固定时间需延长）
      • 固定后PBS漂洗
• 脱水、透明与浸蜡
  • 目标
    • 将组织中的水分完全置换为石蜡，使组织变硬并能被切片
  • 此过程通常在自动脱水机中完成。手动操作需严格控制时间
  • 脱水（梯度酒精去除水分）
    • 将组织块放入脱水盒或包埋盒中
    • 流程
      • 70% 乙醇（1-2小时）→80% 乙醇（1-2小时）→90% 乙醇（1-2小时）→95% 乙醇I（1小时）→95% 乙醇II（1小时）→100% 乙醇I（1小时，必须无水）→100% 乙醇II（1小时，确保彻底脱水）
  • 透明（用二甲苯置换酒精，使组织透明）
    • 流程
      • 二甲苯 I：30-60分钟（至组织呈透明状）→二甲苯 II：30-60分钟
    • 注意
      • 二甲苯有剧毒性，必须在通风橱内操作，不能直接倒入下水道
  • 浸蜡（用液态石蜡置换二甲苯）
    • 流程
      • 石蜡 I：1-2小时（60°C恒温箱）→石蜡 II：1-2小时（60°C恒温箱）
    • 注意
      • 将组织转移至已熔化的石蜡（通常熔点为56-58°C）中
      • 浸蜡务必充分，否则切片时组织会碎裂
• 包埋
  • 目标
    • 将浸透蜡的组织块铸成规则的石蜡块，便于切片
  • 流程
    • 将熔化的石蜡倒入包埋模具中→用预热的镊子迅速将组织从蜡缸中取出，放入模具底部中央，注意所需切面的朝向（通常为冠状面或矢状面）。脑干或小脑切片可能需要特定角度→将包埋盒底座扣在模具上，轻轻加满石蜡→移至冷台上，使石蜡完全凝固→凝固后，从模具中取出蜡块，修整边缘备用
• 切片
  • 目标
    • 用切片机切出连续、厚度均匀的薄片
  • 流程
    • 安装： 将修整好的蜡块固定在切片机的样品夹上
    • 粗修： 用粗切模式，快速修整组织表面，直到暴露出完整的所需切面
    • 细修与切片
      • 调整切片厚度（通常为 4-7 μm）→旋转切片机手轮，切出连续、光滑的蜡带→用毛笔轻轻托住蜡带
    • 展片
      • 准备一个 42-45°C 的恒温水浴锅→用小镊子和毛笔将长度合适的蜡带（含目标组织）轻柔铺展于水面上。蜡带会受热自然展开
    • 捞片
      • 用防脱载玻片（如APES或多聚赖氨酸处理过的）伸入水中，从蜡带下方将其捞起→确保组织位于玻片中央，无皱褶
    • 烘片
      • 将玻片竖直置于玻片架，在 37-42°C 烘箱中过夜烘干，使蜡片牢固贴附
• 脱蜡、复水与染色（以HE染色为例）
  • 目标
    • 去除石蜡，使组织回到水相，并进行染色
  • 流程
    • 脱蜡
      • 二甲苯 I（10分钟）→二甲苯 II（10分钟）
    • 复水（梯度酒精至水）
      • 100% 乙醇 I（5分钟）→ 100% 乙醇 II（5分钟）→95% 乙醇（3分钟）→80% 乙醇（3分钟）→ 70% 乙醇（3分钟）→蒸馏水浸洗（3分钟）
    • 苏木素染色
      • 浸入Harris苏木素染液： 3-5分钟（细胞核染成蓝色）→自来水冲洗返蓝
    • 分化与返蓝
      • 1% 盐酸酒精（分化液）中浸提数秒，洗去多余染料→立即用自来水充分冲洗返蓝
    • 伊红染色
      • 浸入伊红染液：1-3分钟（细胞质染成粉红色）→自来水稍洗
    • 脱水、透明（为封片做准备）
      • 快速通过梯度酒精脱水： 70%， 80%， 95%， 100% I， 100% II，每级约1-2分钟→二甲苯 I & II 透明，每级3-5分钟
• 封片与观察
  • 封片
    • 从二甲苯中取出玻片，用纸巾吸干背面和边缘多余液体（组织区域勿干）→在组织中央滴一滴中性树胶→用盖玻片以一定角度缓慢覆盖，避免产生气泡
  • 晾干与观察
    • 将玻片平置于通风处晾干（通常需数小时至过夜）→干透后，即可在光学显微镜下观察、拍照
• 关键注意事项
  • 时间控制：固定、脱水、透明、浸蜡的时间需根据组织大小和类型优化
  • 防脱片： 脑组织富含脂质，易脱片。必须使用防脱载玻片，并充分烘片
  • 毒性安全： 二甲苯、甲醛等试剂有毒，全程应在通风橱内操作，并做好个人防护（手套、口罩、实验服）
  • 刀片锋利： 切片刀或刀片必须锋利，否则会导致组织压缩、撕裂
  • 水质洁净： 展片用水需是蒸馏水或去离子水，防止污染
• 总结
  • 试剂
    • 三溴乙醇、4%多聚甲醛磷酸缓冲液、PBS、100/95/90/80/70%乙醇、二甲苯、石蜡、蒸馏水、Harris苏木素染液、1%盐酸酒精（分化液）、伊红染液、中性树胶
  • 仪器
    • 石蜡切片机、自动脱水机、60℃恒温箱、包埋模具、包埋盒、42-45℃恒温水浴锅、防脱载玻片、37-42℃烘箱