A CD40-Targeted IL-21 fusokine

这是一篇关于A CD40-Targeted IL-21 fusokine的思维导图，内容涵盖了从分子构建到体内外功能验证的完整实验链条，主要分为五个核心模块。首先是CD40ScFv-IL21的设计、表达与纯化，包括CD40单链抗体（scFv）、连接肽（linker）与IL-21的基因构建、蛋白表达，以及通过FPLC进行的融合蛋白纯化。其次是细胞来源与刺激体系，详细说明了通过Ficoll密度梯度离心分离外周血单核细胞（PBMCs），并利用流式细胞术分选纯化B/T细胞（纯度>95%），设置了对照组（未刺激B细胞）及不同刺激条件的实验组（如B-CD40scFv-IL-21-CpG）。第三部分是体外实验，涵盖了流式细胞术表型分析、IL-10的ELISA检测、细胞活力与表型稳定性评估、CD40和IL-21信号通路的Western blot分析、趋化因子阵列以及T细胞抑制实验。第四部分是RNA-seq，涉及样本制备、PCA/Venn/Volcano/Heatmap等生物信息学分析，以及与公共单细胞RNA-seq数据库的参考比对。最后是体内异种移植移植物抗宿主病（GVHD）模型，用于验证该融合蛋白的体内功能。

A CD40-Targeted IL-21 fusokine enables rapid generation of human IL-10⁺ granzyme B⁺ regulatory B cells

• Design, expression and purifcation of CD40ScFv-IL21
  • Design and construction: CD40 single-chain antibody (scFv) + linker + IL-21
  • ScFvCD40-IL-21 expression
  • Purifcation of CD40scFv–IL-21 fusion protein by FPLC
• Cell sources and stimulation system
  • PBMCs were isolated by Ficoll density gradient cen-trifugation
  • B/T cells purifcation（fow cytometry（Purity＞95%））
  • Cell stimulation
    • Con：Un.B cells
    • EG A：B-CD40scFv–IL-21-CpG
    • EG B：B-CpG
• In vitro experiments
  • Flow cytometry phenotypic analysis
  • IL-10 ELISA
  • Cell viability and phenotypic stability
  • Western blot analysis of CD40 and IL-21 signaling in human B cells
  • Chemokine array
  • T-cells suppression assay
• RNA-seq
  • Human RNA-seq sample preparation
  • PCA+Venn+Volcano+Heatmap
  • Reference-based comparison with public single-cell RNA-seq datasets
• In vivo xenogeneic graft-versus-host disease (GVHD) model