层析分离技术思维导图

一张思维导图带你学习层析分离技术，内容有基本概念、层析的分类、层析的核心、层析分离、常用的支持剂、层析的基本操作。

层析分离技术

• 核心
  • 选用的介质
• 层析法又称为色谱法
• 层析分离：利用化 合物中各组分的物 化性质(分子大小型 状，极性，吸附力， 亲和力，分配系数 等)的不同，使各组 分以不同程度分布 在两相中而进行分 离和分析的方法
• 基本概念
  • 固定相：层析的一个基质。它可以是固体物质(如吸附剂，凝胶，离子交换剂等)，也可是液体(如固定在硅胶或纤维素上的溶液)，这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。对层析的效果起到关键的作用。
  • 流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离物质朝一个方向移动的液体，气体等。柱层析中称为洗脱剂薄层层析时称为展层剂。也是层析分离中重要影响因素之一。
  • 分配系数：在一定条件下，某种组分在固定相和流动相中浓度（含量）的比值。常用K表示。
• 常用的支持剂
  • 硅胶
  • 纤维素
  • 硅藻土
  • 氧化铝
  • 交联葡聚糖凝胶等
• 层析的基本操作
  • 装置选择：基质均匀性柱层析的L/d比值
  • 上样和洗脱：上样均一性，洗脱装置
  • 结果检测：目的不同，检测方法不同，活性检测
• 层析的分类
  • 固定相基质的形式
    • 纸层析
      • 原理：以滤纸为支持物，一般滤纸能吸收22-25％的水。以滤纸纤维的结合水为固定相，而以有机溶剂作为流动相。
      • 展开时，有机溶剂在滤纸上流动，样品中各物质在两相间不断进行分配，由于各物质有不同分配系数，移动速率不同，从而达到分离。
      • 溶质在滤纸上移动的速率可用Rf值表示：
      • Rf＝溶质斑点中心的移动距离/溶剂前沿移动的距离。Rf值决定于分离物质的分配系数和两相的体积比。在一定实验条件下，两相体积比一定，Rf决定于分配系数。
    • 薄层层析
    • 柱层析
  • 流动相的形式
    • 液相层析
    • 气相层析
      • 气相色谱
        • 原理：气相色谱法是利用气体作流动相的色层分离分析方法。汽化的试样被载气（流动相）带入色谱柱中，柱中的固定相与试样中各组份分子作用力不同，各组份从色谱柱中流出时间不同，组份彼此分离。
        • 组成
          • 载气：常用的气体有氢气，氮气，氦气，CO2,氩气等，
          • 层析柱：仪器的重要组成部分，
          • 支持物（担体）：作用是支持固定液，这种物质无吸附性能，是惰性的，即不与固定相或要分离的组分起任何反应，高温下也不变性。
          • 固定液：没有挥发性，对要分离的组分有足够的溶解能力。
          • 样品：一般采用ug到mg量范围，并尽可能以浓缩方式送入柱内。
          • 鉴定器：是测定流出气体组分的装置，要求能迅速地反应组分的变化，有很好的稳定性，有足够的灵敏度，重复性好，而且结构简单，与组分无作用，有较宽的操作温度
  • 分离原理
    • 吸附层析
      • 吸附：任何两个相之间都可形成一个表面。其中一个相的物质或溶液在两相间的表面上密集的现象。
      • 吸附剂：凡是能够将其它物质集聚到自己表面上的物质。
      • 吸附物：能聚集在吸附剂表面的物质
      • 原理：在洗脱过程中，柱内不断地发生解吸，吸附，再解吸，再吸附的过程。即：被吸附的物质被向下移动，又遇到新的吸附剂颗粒，重新把该物质自溶剂中吸附出来，后面流下的溶剂又把物质解吸而向下移动，然后再被下层吸附剂所吸附。
    • 分配层析
      • 分配层析：利用各组分的分配系数不同而分离的方法。
      • 固定相：极性溶剂（例如水、稀硫酸、甲醇等）能和多孔的支持物(常用的是吸附力小、反应性弱的惰性物质如淀粉、纤维素粉，滤纸等)紧密结合，呈不流动状态
      • 流动相：非极性的有机溶剂
    • 凝胶过滤层析
      • 原理：依据是多孔的载体对不同体积和不同形状分子的排阻能力的不同，从而对混合物进行分离
      • 优点：凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，温度范围广，不需要有机溶剂，分离效果好
      • 缺点：样品被不断稀释，上样量不能太大，否则分辨率变差
      • 影响分离效果的因素
        • 流速
        • 加样体积
        • 样品浓度
        • 离子强度
      • 凝胶过滤层析的介质
        • 葡聚糖系列
        • 琼脂糖系列
        • 聚丙烯酰胺系列
        • 多孔硅胶
      • 应用
        • 脱盐
        • 分离提纯
        • 测定高分子物质的分子量
        • 高分子溶液的浓缩
        • 蛋白质复性研
    • 离子交换层析
      • 离子交换层析：利用离子交换剂上的可解离基团对各种离子的亲和力不同而分离组分的一种层析。
      • 原理：利用物质的电荷和层析载体的电荷间的相互作用，进而达到分离纯化的目的
      • 基本操作：加样、洗脱、洗脱液的监测收集及组分鉴定、离子交换剂的清洗、再生和保存
      • 离子交换剂的选择：取决于被分离的物质在其稳定的pH下所带的电荷，如果带正电，则选择阳离子交换剂；如带负电，则选择阴离子交换剂。
      • 离子交换剂的处理：膨化、水悬浮、酸碱浸泡
      • 缓冲液的选择：保证各个待分离物质的稳定；使待分离样品与离子交换剂有较稳定的结合，而尽量使杂质不与离子交换剂结合或结合不稳定；注意平衡缓冲液中不能有与离子交换剂结合力强的离子，否则会大大降低交换容量，影响分离效果
      • 层析柱的选择：亲和力相差不多而需要交换剂的体积较大增加柱长为宜，使待分离的组分被洗脱后再结合于交换剂上的概率增加，柱的直径与高度的比以1：20左右为宜。
      • 应用
        • 水处理
        • 分离纯化小分子物质
        • 分离纯化大分子物质
    • 亲和层析
      • 亲和层析是利用配基、配体之间专一可逆结合性质进行物质分离的方法,因此其专一性、选择性是极高的
      • 配体：与待分离的物质有适当的亲和力；与待分离的物质之间的亲和力要有较强的特异性；与基质稳定的共价结合；自身应具有较好的稳定性
      • 基本操作
        • 选择适当的配体
        • 将配体固定化到基质上
        • 将目的蛋白混合液加样到基质上
        • 除去非特异性结合的蛋白质
        • 洗脱纯的目的蛋
      • 基本应用
        • 免疫亲和层析
        • 凝集素和糖蛋白亲和层析
        • 含有辅酶的酶类的亲和层析
        • 酶和蛋白类型抑制剂的亲和层析
        • 肝素为配体的亲和层析
        • 染料配体亲和层析
        • 金属螯合层析