基因工程

包含基因文库的构建、目的基因的获取、DNA体外重组与基因转移、重组子的筛选与鉴定、外源基因的表达等等。

基因工程

• 绪论
  • 基因工程的概念:广义、狭义P1
  • 现代分子生物学领域理论上的三大发现：P2
  • 现代分子生物学领域技术上的上的三大发明：P3
  • 基因工程三大元件：载体、供体、受体
  • 细菌的保守序列：16srDNA
• 工具酶
  • 限制性核酸内切酶
    • 寄主细胞的限制和修饰作用：名词解释P21、两个作用P22
    • II型限制性核酸酶的特性P22
    • 命名：属名的第一个大写字母（斜体）＋种名的前两个小写字母（斜体）＋株名＋酶类型I、II、III
    • 特性：具有回文序列
    • 识别序列出现的频率：4的n次方分之1，n为识别序列的核苷酸数目
    • 区分同尾酶、同位酶、同裂酶:P26
    • 使用两种不同的酶时如何控制用量：P27
    • 影响因素
      • 怎么提高DNA样品的纯度P29：1、2、3
      • DNA的甲基化程度：不可控
      • 星号活性：名词解释P30
  • DNA连接酶
    • 种类：3种 P32
    • 裂口：nick和gap的区别 P31和P36
    • Klenoow的概念、特性、用途 P36
  • 碱性磷酸酶：防止载体自身环化
• 载体
  • 质粒载体
    • 电泳速率：SC型＞L型＞OC型
    • 复制类型：松弛新和松弛型（√）
    • 不亲和性：概念
    • 转移性
    • 接合型和非接合型（√）
    • pSC101
    • 理想质粒载体必备条件5点P54
    • 3个组成部分P55
    • 克隆质粒载体定义P58、质粒表达载体定义以及3个必须结构P59、60
  • 入噬菌体：裂解周期和溶原性周期
  • 概念、需要具备的三个基本条件P50
• 核酸基本操作技术
  • OD260/OD280比值在1.7~2.0之间，说明DNA纯度好 过低：蛋白质污染 过高：RNA污染或DNA降解
  • 碱裂解法提取质粒的原理和流程：P97
  • 纯RNA样品的比值应在1.9~2.1之间
• 聚合酶链式反应技术
• 外源基因的表达
  • 外源基因在大肠杆菌中的表达
    • 需克服哪些障碍？10.11的笔记
    • 常用的大肠杆菌表达载体主要的5个组成部分P187~191
    • 外源蛋白质表达部位
      • 包涵体的概念、形成原因、该形式优点和缺点
      • 周质：细胞膜外膜和内膜之间
      • 重组蛋白分泌到胞外培养基中：非常难
      • 以融合形式表达重组蛋白：目前采用较为广泛
    • 提高外源基因表达效率的8个方法P194~198
  • 真核细胞表达系统概述
    • 酵母表达体系 5个优点P203
    • 昆虫细胞表达体系 概念、从草地贪夜蛾的卵巢克隆来的sf21细胞株、3个优点P204、205
    • 哺乳动物细胞表达体系
• 重组子的筛选与鉴定
  • 菌落印记原位杂交P179
  • Southern印记杂交（检测DNA）
  • Northern印记杂交(检测mRNA)
  • Western印记杂交(检测蛋白质）
  • 免疫沉淀检测法（检测重组菌落）
  • 限制性核酸内切酶酶切片段分析法P18
• DNA体外重组与基因转移
  • 抗生素抗性筛选
  • ZPTG诱导下的X-gal蓝白斑显示反应筛选
  • 粘性末端、平末端分别与载体DNA的连接方法P163
  • 转化与转染P171
  • 感受态细胞概念、制备方法的名称P172
  • 热激发的过程P172
  • 转化率计算公式P172
• 目的基因的获取
  • 最简单：PCR制备获得（必须做TA克隆）
  • 化学合成法、从基因组文库中钓取目的基因、逆转录法获得真核目的基因
• 基因文库的构建
  • 基因文库概念、基因组文库和cDNA文库P135
  • 需组建多个cDNA文库的原因：丰度差异P142