细胞工程 动物细胞工程 干细胞技术

教材：细胞工程第二版 安利国 内容：第二篇 动物细胞工程 干细胞 重点已标出

干细胞技术

• 干细胞的概念
  • 指一类具有自我更新 (Self-renewing) 能力，并在一定条件下可分化成为各种功能细胞的细胞
• 干细胞的分类
  • 分化潜能
    • 全能性干细胞 (Totipotency Stem Cells)
      • 具有形成完整个体的分化潜能。
    • 多能性干细胞 (Multipotency Stem Cells)
      • 具有分化出多种细胞组织的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力
    • 单能干细胞 (Monopotency Stem Cells)
      • 只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化
  • 发育阶段
    • 胚胎干细胞 (Embryonic stem cell)
      • 受精卵分裂发育成囊胚时，内细胞团(Inner Cell Mass)的细胞经分裂培养，即得到胚胎干细胞
    • 成体干细胞 (Adult stem cell)
      • 指成年动物或人体的一些组织和器官中具有修复和再生的能力的干细胞。
      • 造血干细胞(Haematopoietic Stem Cells, HSCs) 、骨髓间充质干细胞 (Mesenchymal stem cells, MSCs)、神经干细胞 (Neural stem cells, NSCs)、肌肉干细胞 (Muscle stem cell)、成骨干细胞 (Osteogenic stem cell)、视网膜干细胞 (Retinal stem cell) 等。
• 干细胞的特性
  • 本身不处于分化途径的终端
  • 理论上能无限地增殖分裂
  • 既可连续分裂几代，也可较长时间处于静止状态
  • 增殖分裂
    • 对称分裂——形成两个相同的干细胞
    • 非对称分裂——由于细胞质中的调节分化蛋白不均匀地分配，使得一个子细胞不可逆地走向分化的终端成为功能专一的分化细胞，另一个保持亲代的特征，仍作为干细胞保留下来。
• 成体干细胞
  • 分布于成体组织中尚未分化的、具有自我更新能力、并能构建和补充相应组织的各种类型细胞潜能的干细胞
  • 可塑性
    • 来源于各种组织的成体干细胞在一定条件下，它们有可能分化为其它类型的细胞
  • 类型
    • 造血干细胞 (Haematopoietic Stem Cell, HSC)
      • 体内各种血细胞的唯一来源
      • 高度的自我更新或自我复制能力（不对称分裂）
      • 可分化生成所有类型的血细胞。
      • 通过筛选CD34+细胞可使造血干细胞得到富集
      • 临床应用
        • 造血干细胞移植
          • 最初采用骨髓移植法
          • 外周血干细胞移植成为造血干细胞移植的另一来源
        • 细胞治疗
        • 基因治疗
          • 基因治疗的靶细胞
            • 目的基因可以长期表达，可使病人终生受益
            • 可分化为各系细胞，分化成的细胞可随血液循环到靶器官，最大限度发挥治疗作用
            • 有可能缓解如地中海贫血、镰状细胞贫血等与造血异常相关疾病的症状。
        • 临床应用前景
          • 低毒性（或无毒性）、一次给“药”长期有效、可无需完全了解疾病发病的确切机理、自身移植可避免免疫排斥
    • 间充质干细胞(MSC)
    • 神经干细胞(NSC)
    • 血管内皮干细胞、胰岛干细胞、肿瘤干细胞
• 胚胎干细胞
  • 胚胎干细胞具有全能性，可以自我复制（或更新）并具有分化为体内所有组织的能力。它是一种高度未分化细胞，具有发育的全能性，能分化出成体动物的所有组织和器官，包括生殖细胞。
  • 分类
    • 畸胎瘤细胞 (teratocarcinoma cells, EC)
    • 胚胎干细胞 (embryonic stem cells, ES)
    • 原始生殖细胞 (primordial germ cells, PGC或EG)
  • 研究历史
    • 1958
      • Stevens
        • 畸胎瘤
          • 小鼠早期胚胎
    • 1974
      • Brister
        • EC细胞注射到小鼠囊胚腔
          • 得到嵌合体
    • 1981
      • Evans和Kaufman
        • 延迟着床的小鼠早期胚胎在STO饲养层上培养
          • 小鼠ES细胞为EK细胞
    • 诺贝尔
      • 2007
        • 胚胎干细胞及其在基因打靶中的作用
      • 2012
        • 日本科学家
          • 诱导多能干细胞的研究
  • 胚胎干细胞的分离方法
    • 来源于早期胚胎的内细胞团
      • 早期胚胎发育到囊胚期后，通过手术分离内细胞团或延迟着床的囊胚期内细胞团，在含有饲养层和/或白血病抑制因子 (LIF) 的培养条件下培养，可得到胚胎干细胞。
      • 集落（鸟巢状）生长，边缘清楚，表面平滑，结构致密，隆起生长，细胞之间界限不清楚
      • 细胞端粒酶活性水平高，表面标记碱性磷酸酶呈阳性
    • 从原始生殖嵴分离培养
    • 利用体细胞核移植的方法建立
    • 利用细胞融合方法
    • 利用单个卵裂球制备胚胎干细胞
    • 利用基因转移技术从成纤维细胞诱导产生
  • 胚胎干细胞的鉴定
    • 形态学检测
      • 细胞呈圆形、核大、胞浆少；细胞排列紧密，呈集落形生长；集落常呈岛状、巢状。
    • 遗传学检测
      • 正常的二倍体核型
    • 酶活性检测
      • ES细胞内端粒酶和碱性磷酸酶活性高
    • 细胞表面标志物检测
      • ES细胞膜表面有特殊的标记：如， OCT-4， SSEA-3，SSEA-4等
    • 体内分化潜能
      • 植入裸鼠皮下，可诱发形成畸胎瘤；可分化为三个胚层的细胞；能参与嵌合体的形成
    • 体外分化潜能
      • 可形成类胚体，可在体外诱导分化为三个胚层的细胞
  • 干细胞诱导分化的常用方法
    • 加入诱导细胞分化的因子或化学物质
      • VGEF、bFGF 、DMSO和RA
    • 将ES细胞与特定的细胞共培养
    • 将某种分化诱导因子的基因转入ES 细胞内
  • 胚胎干细胞的用途