细胞工程

包括大规模细胞培养是生产生物产品的基本技术、细胞核移植是获得各种克隆动物的关键技术、基因转移是定向改造细胞表型的基本技术等。

细胞工程

• 细胞工程概述
  • 细胞工程是生物工程（bioengineering)的基本组成部分之一。生物工程也称生物技术(biatechdlogy）.它与人类社会的进步和发展密切相关。
  • 20世纪70年代初，DNA重组技术的出现，使人们能通过对基因的人为操作，以实现对微生物、植物和动物遗传性状的定向改造，这样的技术体系被称为遗传工程（genetic enginering)或基因工程(gene engineering)。
  • 从理论上讲，任何生物体的性状都可以被定向地改造或修饰。尤其在近年中，人类基因组、干细胞、基因组修饰以及动物克隆等领域的研究或技术的快速发展，似乎把生物技术的应用范围扩大到了整个生命科学乃至整个人类社会。
  • 生物技术的发展速度很不平衡。在过去相当长的历史时期，它只表现为生产劳动中的经验积第和简单利用，对社会的影响有限。直到现代，由于微生物学、细胞生物学、遗传学和分子生物学的发展，生物技术的内容开始急骤扩大，而且成为人类社会发展的重要因素之一。
• 动物细胞工程涉及的主要技术
  • 据操作对象的不同，细胞工程可分为微生物细胞工程、植物细胞工程和动物细胞工程，本节仅介绍动物细胞工程。
    • 一、大规模细胞培养是生产生物产品的基本技术
      • （一）大规模细胞培养的原则是扩大培养规模和降低成本
        • 增加培养容积
          • 一般地说，培养容 积越大，细胞的产量就越高。
        • 增大细胞的附着面积
          • 微载体
          • 中空纤维
          • 微胶囊
        • 抑制细胞的凋亡
          • 研究表明，细胞凋亡是导致培养器中细胞死亡的主要原因。
        • 无血清培养
          • 成分
            • 基础培养基，常用的有RPM11640、MEM、DMEM、Ham'sF12、DMEMF12等
            • 生长因子和激素，常用的有胰岛素、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子及生长激素等
            • 基质，常用的有纤维黏连蛋（fibronectin)血清铺展因子（senum spreading fcoc)、胎球蛋自（feuin）、胶原及多聚赖氨酸等
      • （二）大规模细胞培养有四种基本培养系统
        • 悬浮培养系统
          • 对于所有的培养系统来说，悬浮培养系统的细胞产量是最高的，但它仅适合于可在培养液中悬浮生长的细胞。
        • 气流驱动培养系统
          • 气流驱动培养系统的主要优势在于它简化了设计，因为 它不需要搅拌器中的发动机和搅拌装置。
        • 微载体培养系微载体持养系统
          • 非常适合于具有贴壁生长，特性细胞的大规模培养。
        • 灌连培养系统
          • 比较适合于目的为收集某特定分泌蛋白质的大规模细胞培养。
      • （三）影响细胞生长的因素主要与营养供应和毒物生成有关
        • 鉴定细胞健康状况
          • 荧光或染色剂
          • 生化指标
    • 二、细胞核移植是获得各种克隆动物的关键技术
      • （一）核移植技术仍处于不断改进中
        • 受体细胞的选择
          • 受精卵及处于MI期的卵母细胞的细胞质，可以使所植入的细胞基因组的行为发生重编程（reprogramming)、以至处于不同分化成年体细胞的核得以去分化、恢复到全能性状态。由此获得的重编程，从而获得其遗传背景完全源于供核细胞的动物个体。
        • 供核细胞的选择
          • 对不同供核细胞来源的克隆研究结果表明，克隆效率一般随其供核细胞分化程度的提高而下降。
        • 去核
          • 紫外线照射去核
          • 盲吸法去核
          • 蔗糖高渗处理去核法
          • 透明带打孔去核法
          • 超速离心法
        • 重构胚的组建
        • 重构胚的激活
          • 化学激活
          • 电激活
        • 重构胚的培养与移植
          • 胚被激活后，须经一定时间的体外培养，或放入中间受体动物（家兔、山羊等）的输卵管内孵育培养数日，待获得发育的重构胚（囊胚或桑葚胚）后，方可将之移植至受体的子宫里，经妊娠、分娩获得克隆个体。
      • （二）核移植技术可使用不同的供核细胞
        • 胚胎细胞核移植
          • 成熟卵母细胞比受精卵更适于用作细胞核移植的受体细胞， 且发育至桑葚胚的细胞核，经显微注射法植人去核的成熟卵母细胞而得到的重建胚，仍具有发育的全能性。
        • 成体细胞核移植
          • 体细胞核移植的成功，是20世纪生物学突破性成就之一，尤其是在理论上证明：即便是高度分化的成体动物细胞核在成熟卵母细胞中仍然能被重编程，表现出发育上的全能性。
    • 三、基因转移是定向改造细胞表型的基本技术
      • （一）物理和化学转化法简便易行
        • 电穿孔法
        • 显微注射法
        • 脂质体包埋法
        • 磷酸钙共沉淀法
        • DEAE
      • （二）生物转化法常用病毒基因组作为转化载体
        • 将外源基因通过病毒感染的方式导入动物细胞内是一种常用的基因转导方法。根据动物受体细胞类型的不同，可选择使用具有不同宿主范围和不同感染途径的病毒基因组作为转化载体。目前常用的病毒载体包括：DNA病毒载体（腺病毒载体、腺相关病毒载体、牛痘
    • 四、细胞重编程技术可将一种类型细胞转变为另一类型细胞
• 动物细胞工程的应用
  • 细胞工程是生物工程的重要组成部分，在医学实践中有着极为广泛的应用，研究人员通过细胞工程技术生产了大量的医药产品、医学材料，建立了一些新的疗法。
    • 一、利用细胞工程生产医用蛋白质
      • （一）单克隆抗体广泛应用于生物医药学领域
        • 作为体外诊断试剂
        • 作为体内诊断试剂
        • 作为导向药物的载体
        • 作为治疗药物
      • （二）获得复杂人体蛋白需用真核动物细胞表达系统
    • 二、基因工程动物有非常广阔的应用前景
      • （一）基因工程动物可用做疾病的动物模型
      • （二）基因工程动物可作为高效的动物生物反应器
      • （三）基因工程动物有望解决人类移植用器官
    • 三、组织工程是通过生物和工程学手段在体外前建 组织和器官的技术体系
      • 组织工程皮肤
        • 细胞背景明确，产品质量可控，可有效防止异源皮肤移植时可能导致的疾病传染。
        • 来源充足
        • 免疫性弱
        • 贮存方便，可低温冷冻保存，使用简便
        • 能为自体细胞修复伤口提供良好的生长环境
      • 组织工程膀胱
    • 四、细胞治疗是植入正常细胞以替代病变细胞的治疗方法
      • （一）干细胞及其分化后裔细胞在细胞替代治疗中具有重要价值
        • 神经系统疾病
          • 应用干细胞治疗神经系统损伤是一个迅速发展的领域
        • 肿瘤
          • 肿瘤患者经亚致死量照射后，射线可以杀灭肿瘤细胞并摧毁造血系统，然后通造血细胞移植的方法重建患者的造血功能。造血干细胞移植的新应用是治疗恶性肿瘤。
        • 其他疾病
          • 细胞治疗在其他疾病如：心脏病、骨骼和肌腱损伤、烧伤等领域同样有巨大的应用前景。
      • （二）基于工程化细胞的基因治疗具有应用前景
        • 干细胞和一些永生化的细胞可以作为基因治疗的载体。