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分子生药学基本技术原理分子生药，包含绪论：生药（crude drugs）、概念和特点、任务：从分子水平研究中药的鉴定、从分子水平研究中药的质量形成等。
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分子生药学
绪论
生药（crude drugs）
未作加工或经简单加工的药材
起源
1995年黄璐琦院士首次提出“分子生药学（molecular pharmacognosy）”的概念
概念和特点
概念
分子生药学：是在分子水平上研究中药的鉴定，质量的形成及活性成分生产的一门学科
主要研究对象
生物来源中药及其资源
任务
从分子水平研究中药的鉴定
从分子水平评价中药的基源物种
从分子水平研究中药鉴定
从分子水平研究中药的质量形成
从分子水平研究道地药材的形成
从分子水平研究中药种质资源
中药活性成分的生物合成与生产
从分子水品解析中药活性成分的生物合成途径
研究中药活性成分的生物合成
基本技术原理
DNA基本技术原理
DNA
碳，氢，氧，氮，磷组成
基本单位：脱氧核糖核苷酸
脱氧核糖
磷酸
含氮碱基
A:腺嘌呤
G：鸟嘌呤
C：胞嘧啶
T：胸腺嘧啶
原核分布在拟核中，真核分布在细胞核和线粒体与叶绿体中
双螺旋结构
多核苷酸链
以基因形式负载遗传信息
DNA提取与纯化
DNA提取方法 (Tris饱和酚）
采集样品→组织粉碎→加入提取buffer，破坏细胞膜→离心取上清液→加入变性剂：去蛋白→ 温浴30min（去除RNA）→加入氯仿（除酚）→沉淀DNA（异丙醇或乙醇）→去除盐离子（70乙醇）→ 风干→溶解：得到DNA→保存
DNA纯度鉴定
紫外分光光度法
A₂₆₀/A₂₈₀判断是否有蛋白质污染
A₂₆₀/A₂₈₀在1.8~2.0，说明纯度高
荧光光度法用溴化乙锭（EB）示踪核酸电泳结果
DNA的半保留复制
PCR （聚合酶链式反应）
基本原理
DNA的变形，复性，半保留复制
所需物质：模板DNA，引物，DNA聚合酶，dNTP，水，镁离子，反应缓冲液
基本过程
变性：模板DNA加热到94⁰C，DNA解链，成为单链DNA
退火：变性完全后降温至55℃，引物与模板DNA单链碱基互补配对结合
延伸：升温至72℃，进行半保留复制，和成新的DNA链
操作方法
反应管中加入反应体系→放入反应室，设置PCR程序→启动→电泳检测
影响因素
引物，DNA聚合酶，dNTP，模板，镁离子，温度参数，循环次数
种类
反转录PCR
巢式PCR
实时荧光定量PCR
重叠PCR
子主题
应用
PCR克隆技术
PCR定点突变和基因融合
DNA测序
DNA指纹技术
DNA体外重组
是指利用限制性内切酶切割DNA以获得目的DNA片段， 然后用DNA连接酶将目的DNA片段与合适载体连接，形成重组DNA的过程
常用载体
载体特点
能独立自我复制
容易分离纯化
有一段非必需区域
质粒
严谨性质粒
松弛型质粒
质粒相容性：两种不同质粒在同一细胞内能稳定共存，两者的复制控制互不干扰
质粒不相容性：DNA重组技术基于此性质
理想质粒载体条件
分子小
拷贝数多（松弛型质粒）
多个单一酶切位点
赋予宿主细胞易于检测的表型
λ噬菌体
目的DNA与载体重组
外源DNA倒入宿主细胞
平末端
粘性末端
筛选和鉴定
目的基因表达
DNA测序方法
第一代测序方法
化学降解法
双脱氧链终止法
合成体系：引物，DNA模板，DNA聚合酶，dNTPs，ddNTPs（双脱氧核苷三磷酸）
序列读取：从上到下依次读取
优点：准确率高，读长长
sanger发明
毛细管电泳测序
第二代测序技术（高通量）
焦磷酸测序技术
测序引物与单链DNA模板杂交；与四种酶，两种底物孵育
具体流程
每加入一个dNTP，在聚合酶作用下产生一个焦磷酸
硫酸化酶转化PPi为ATP，ATP是荧光素酶发出荧光（强度与核苷数量成正比）
Next generation sequencing（NGS）
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边合成边测序
读长长
Illumina/Solexa Sequencing
特点：高通量，高准确性，高灵敏度，运行成本低
原理：边合成边测序
步骤：1.文库制备 2.产生DNA簇 3.测序 4.数据分析
第三代测序技术 （速度快，精度高，读长长）
单分子实时测序等
缺点
单个碱基准确率低
修正：二代校正，提高覆盖度自我校正，参考基因组校正
可分析内容
新转录本基因的发现
可变剪接分析
可变多聚腺苷酸分析
融合基因分析
DNA变异与分子标记
DNA变异来源
基因突变
置换突变（点突变）
转换：同种类碱基交换
颠换：不同种类碱基交换
错义突变（非同义突变）：突变后氨基酸种类变化
同义突变（沉默突变）：突变后氨基酸种类不变
无义突变：使密码子改变为终止密码子
移码突变
插入
缺失
染色体畸变
结构改变
重复
倒位
易位
基因重组
DNA损伤
类型
自发损伤：水解和脱氨基作用
DNA损伤：烷化反应，氧化反应和辐射
DNA损伤后果
复制或转录受阻
DNA序列永久性改变
修复
位点特异性重组和DNA转座
CSSR(保守性位点特异性重组)
发生在两段特定序列之间
保守：反应中不需要其他能量，且每个断裂的键都能被重新连接
转座
发生在特定序列和特定DNA位点之间
将特定的遗传因子从DNA上的某一个地方移位到另一个地方 将这些可移动的遗传因子叫做转座子
转座子
DNA转座子
类病毒反转录转座子
聚腺苷酸反转录转座子
是造成大多数DNA重排的原因
DNA重组技术
重组DNA技术
基因工程六大步骤
获取目的基因
制备载体
基因和载体的体外重组
重组基因的导入和重组子的检测
克隆基因的表达
基因工程产物的检测或分离
基因工程中的工具酶和载体
限制酶
I型
II型
特点
识别4~8bp的回文结构位点
切割位点在识别序列内
占总限制酶的93%
分类
同裂酶：来源不同，但能识别相同的核苷酸序列
1.切割位点一样
2.切割位点不一样
3.切割位点一样，但识别的敏感程度不一样
切割后产生的末端
5'末端突出型
3'末端突出型
载体
克隆载体
表达载体
DNA连接酶
功能
催化DNA切口处的5'磷酸基团和3'羟基形成磷酸二酯键，连接两段DNA
NAD作为能量供体
大肠杆菌DNA连接酶
ATP作为能量供体
T4噬菌体DNA连接酶
重组体的筛选与鉴定
β半乳糖糖苷酶系统
X-gal是发色底物，能被β半乳糖苷酶分解而显蓝色
蓝色菌落
β半乳糖苷酶分解X-gal菌落 说明没有插入目的DNA
白色菌落
β半乳糖苷酶没有分解X-gal菌落 说明载体插入目的DNA
根据载体抗药性标志插入失活选择
例如： pBR322质粒含有抗氨苄青霉素基因和抗四环素基因 将外源DNA片段插入抗四环素基因内，从而导致抗四环素基因失活 将宿主菌接种在含氨苄青霉素和四环素培养基上
结果① 两种培养基上均能生长 空载体
结果② 两种培养基上均不能生长 不含载体
结果③ 在含氨苄青霉素的培养基上能生长，含四环素的培养基上不能生长 含有重组DNA
重组DNA技术的一些应用
具有工程生长激素的巨型鲑鱼
营养工程水稻
生产有用的蛋白质
用动物病毒开展基因工程
基因组学
研究基因组的DNA序列，组织结构，功能和进化
真核细胞RNA提取及基因表达研究
RNA概述
RNA种类
mRNA（信使RNA）合成蛋白质的模板
tRNA（转运RNA）
一级结构：单链多聚核苷酸 二级结构：自身折叠形成局部双螺旋，柄环结构 三级结构：骨架上未配对区域自由旋转折叠成不规则碱基配对的复杂结构
rRNA（占总RNA的80%）
非编码RNA
RNA与DNA不同点
1.骨架构成为核糖而不是2’-脱氧核糖;
2.尿嘧啶U替代了胸腺嘧啶T;
3.RNA为单链，且碱基配还有U:G等非规则碱基配对;
4.RNA不形成双螺旋结构，可形成二级和复杂的三级结构。
RNA功能
1.RNA是遗传信息的解码器（tRNA）
2.RNA是从DNA到蛋白质氨基酸序列的遗传信息载体，即遗传信息传递器mRNA
3.酶
外显子：有编码蛋白质作用的DNA序列
内含子：无编码蛋白质作用的DNA序列
RNA提取方法 （酸性酚）
RNA制备条件与环境
1.防止细胞外RNase的污染
2.抑制细胞内RNase
基本步骤
总RNA的提取需要裂解细胞，抑制RNase，使核蛋白体变性 有效的将RNA从DNA和蛋白质的混合物中分离并沉淀，提取出总RNA
RNase抑制剂
DEPC：高活性烷化剂
异硫氰酸胍：蛋白变性
β-ME：破坏NRase中二硫键
RNase蛋白抑制剂：RNase,Promega
提取方法
Trizol（异硫氰酸胍法）
适量样品-液氮研磨-加入适量异硫氰酸胍-剧烈震荡1min-加入适量变性剂-离心 -取上清…醇沉淀，DEPC水溶解
CTAB和试剂盒法
适量样品-液氨研磨-加入适量CTABbuffer-剧烈震荡 -加入适量变性剂 离心 -取上清-沉淀，醇纯化，DEPC水溶解
提取质量控制
①RNase ②抗氧化③gDNA的去除
RNA的定量的储存
定量
紫外分光光度法：A₂₆₀/A₂₈₀=2.0或A₂₆₀/A₂₃₀=2.0表示为纯RNA
琼脂糖凝胶电泳法
28S/18S=2时，认为纯RNA
28S/18S<2时，认为RNA有降解
储存
低温保存（-80℃）
mRNA的分离与纯化
mRNA显著特征：有5'端帽子和3'端尾巴
方法
寡聚（dt）-纤维素柱层析法
微磁球法
电泳技术
在直流电场中，带电粒子迁移的现象
凝胶电泳
凝胶排阻现象
大分子迁移慢
小分子迁移快
基因表达研究技术
主要是通过检测RNA，揭示基因转录水平的表达特征
cDNA文库
①cDNA全长文库②均一化文库③SSHcDNA文库
诱导性表达（从无到有和表达量的变化）
抑制表达
主要技术
转录组分析
转录组：生物全基因组中为RNA合成提供模板的部分
基因芯片技术
表达序列标签技术
基因表达系列分析技术
RNA-seq
Quantitative Real-time PCR
Northern杂交
反转录PCR（RT-PCR）
基因芯片
真核生物基因表达的调控
细胞在不同时间，不同空间以不同的组合表达不同的基因
转录调控
转录起始阶段
①聚合酶与启动子形成闭合式复合体
②开放式复合体，起始泡
③启动子逃离，聚合酶进入转录起始阶段
顺式作用元件（cis-acting element）
启动子，增强子，沉默子，绝缘子，终止子等
鉴定方法：染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq） 测定增强子最佳方法
反式作用因子（trans-acting element）
转录因子TF，miRNA、lncRNA等
很多启动子通过激活因子（协助RNA聚合酶结合DNA） 和抑制因子（阻碍两者结合）进行调控
通过变构和调控RNA聚合酶对结合后的转录调控
远程激活和DNA环化
真核细胞调控蛋白：DNA结合域
螺旋-转折-螺旋
锌指结构
亮氨酸拉链
螺旋-环-螺旋：碱性拉链
表观遗传调控
表观遗传：DNA碱基序列未发生变化，但基因的表达或细胞表型却发生了稳定的、可遗传的变化
引起表观遗传变异的分子机制
DNA甲基化修饰
组蛋白修饰
增加或移除小的化学基团
重塑核小体的构造
染色质重塑
可变剪接
RNA剪接：从pre-mRNA中出去内含子的过程
有些RNA存在不止一种剪接方式，从而产生不同的mRNA，成为可变剪接
调控RNA
转录中的核糖开关：通过小分子浓度改变进行应答来调控基因表达的
核糖开关
调控转录终止
调控翻译起始
siRNA（小分子干扰RNA）
可以在转录或转路后水平通过与DNA或靶标mRNA结合实现对基因的沉默
miRNA（微RNA）
通过与靶标mRNA 完全或部分互补配对，介导靶标mRNA的切割或翻译抑制， 在转录后水平负调控靶标基因的表达。
lncRNA（长非编码RNA）
抑制同源靶基因表达的途径
蛋白质基本技术原理
蛋白质结构概述
氨基-侧链-羧基
肽键：指蛋白质中氨基酸之间的共价键；肽键之间相互连接形成肽链；其中每一单元称为氨基酸残基 构象：描述化学键和原子在三维空间中的排列
一级结构：多肽链 二级结构：α螺旋，β折叠 三级结构：空间折叠结构 四级结构：三级结构之间相互作用
蛋白质功能研究概述
Reporter gene assay （基因分析）
GFP
GUS
luciferase
etc
蛋白质纯化
柱层析
离子交换层析
根据电荷分离
凝胶过滤层析
根据分子量大小分离
2-DE （双向凝胶电泳）
等电聚焦电泳（IEF）
等电点不同进行分离
SDS-PAGE （变性聚丙烯酰胺凝胶电泳）
按多肽链长度不同进行分离
蛋白质组学
蛋白质组学旨在鉴定细胞或生物体的所有蛋白质(包括任何翻译后修饰的形式) 以及它们的细胞定位、功能和相互作用。
中药分子鉴定
中药活性成分 生物合成与生产
道地药材形成的遗传机理
多数启动子，在无调控蛋白时，只微弱地与RNA聚合酶结合，且自动转变为 开放复合体从而启动转录，这导致基因的组成型表达或称本底水平表达
操纵子：DNA抑制结合的位点
