DNA重组和重组DNA技术

参与细菌DNA同源重组的酶有数十种，其中最关 键的是RecBCD复合物、RecA蛋白和RuvC蛋白:、转座重组可使基因移位。

DNA重组和重组DNA技术

• 自然界的DNA重组和基因转移
  • DNA重组和基因转移的方式
    • 同源重组
      • 发生在两个相似或相同DNA分子之间核苷酸序列互换的 过程，又称基本重组
      • 特点：发生在两个DNA分子的同源区 ；不需要特异DNA序列； 是最基本的DNA重组方式
      • 参与细菌DNA同源重组的酶有数十种，其中最关 键的是RecBCD复合物、RecA蛋白和RuvC蛋白:
        • nRecBCD复合物具有三种酶活性，即依赖于ATP 的核酸外切酶活性、可被ATP增强的核酸内切酶 活性以及需要ATP的解旋酶活性。 nRecA蛋白可结合单链DNA（ssDNA），形成 RecA-ssDNA复合物。 nRuvC有内切酶活性，能专一性识别Holliday连接 点，并有选择地切开同源重组体的中间体。
      • Holliday模型的4个关键步骤：
        • 1、两个同源染色体DNA排列整齐；2、一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA 对应的链连接； 3、 通过分支移动产生异源双链DNA； 4、 Holliday中间体切开并修复，形成两个双链 重组体DNA，分别为： 片段重组体(patch recombinant) 拼接重组体(splice recombinant)
          • 片段重组体 切开的链与原来断裂的是同一条链，重组 体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲 本DNA。
          • 拼接重组体 切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双 链区的两侧来自不同亲本DNA。
    • 位点特异重组
      • （一）λ噬菌体DNA的整合
        • λ噬菌体的整合酶识别 噬菌体和宿主染色体的特异 靶位点发生选择性整合。 反转录病毒整合酶可特 异地识别、整合反转录病毒 cDNA的长末端重复序列
      • （二）细菌的特异位点重组
    • 转座重组可使基因移位
      • 大多数基因在基因组内的位置是固定的， 但有些基因可以从一个位置移动到另一位 置。这些可移动的DNA序列包括插入序 列和转座子。
        • 插入序列是最简单的转座元件
        • 转座子转座
    • 原核细胞可通过接合、转化和转导 进行基因转移或重组
      • （一）接合作用 当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互 接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转 移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为接 合作用(conjugation)。
      • （二）转化作用通过自动获取或人为地供给外 源DNA，使细胞或培养的受体细胞 获得新的遗传表型，称为转化作用 (transformation)。
      • （三）转导作用 当病毒从被感染的（供体）细胞释放 出来、再次感染另一（受体）细胞时，发 生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移 及基因重组即为转导作用(transduction)。
    • 细菌可通过CRISPR/Cas系统从病毒 获得DNA片段作为获得性免疫机制
• 重组DNA技术
  • 重组DNA技术的发展史
    • 1865年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验。 1973年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子。 1977年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传 工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的 药物。 1980年 开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂。 1997年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉。
  • 重组DNA技术相关概念
    • DNA克隆
      • Ø 克隆(clone):来自同一始祖的相同副本或拷 贝的集合。 Ø 获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)， 即无性繁殖。 Ø 技术水平：分子克隆(molecular cloning) （即DNA 克隆） 细胞克隆 个体克隆（动物或植物）　 Ø 目的： ① 分离获得某一感兴趣的基因或DNA ② 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）
    • 重组DNA技术中常用的工具酶
    • 重组DNA技术中常用的载体
      • 载体按功能分为 克隆载体 、表达载体
        • 克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意 设计的载体称为克隆载体。
          • 克隆载体应具备的基本特点 Ø 至少有一个复制起点使载体在宿主细胞中进行自主复制， 并能使克隆的外源DNA片段得到同步扩增； Ø 至少有一个选择标志（selection marker）：选择标志是 区分含与不含载体的细胞所必需的，包括抗生素抗性基 因、β-半乳糖苷酶基因（lacZ）、营养缺陷耐受基因等。 Ø 有适宜的RE的单一切点：载体中一般都构建有一段特异 性核苷酸序列，在这段序列中包含了多个RE的单一切点， 可供外源基因插入时选择，叫多克隆位点（multiple cloning sites，MCS）。
        • 表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成 多肽链而特意设计的载体称为表达载体。
          • 根据宿主细胞分为： Ø原核表达载体 Ø真核表达载体
    • 重组DNA技术的基本原理及操作步骤
      • 基本原理 ①目的DNA的分离获取（分） ②克隆载体的选择和准备（选） ③目的DNA与载体的连接（接） ④重组DNA转入受体细胞（转） ⑤重组体的筛选及鉴定（筛）
        • （一）目的基因的分离获取——分 1. 化学合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产 物的氨基酸序列 。 2. 从基因组DNA文库和cDNA文库中获取目 的DNA 3. PCR法
        • （二）载体的选择与准备——选 目的不同，操作基因的性质不同，载 体的选择和改建方法也不同。 Ø 目的： ① 获得某一目的基因或DNA片段 ② 获得目的DNA片段所编码的蛋白质
        • （三）目的DNA与载体连接——接 1. 黏端连接 方式：（1）单一相同黏端连接 （2）不同黏端连接 （3）通过其他措施产生黏端进行连接2. 平端连接 适用于：•限制性内切酶切割产生的平端 •粘端补齐或切平形成的平端3. 粘-平末端连接 n 黏-平末端连接是指目的DNA和载体之间通过 一端为黏端、另一端为平端的方式进行连接。 n 属于定向克隆
        • （四）重组DNA转入受体细胞——转 Ø受体菌条件： 安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态(competent) Ø导入方式： 转化 (transformation) 转染 (transfection) 感染 (infection)
        • （五）重组体的筛选与鉴定——筛 1. 借助载体上的遗传标志进行筛选 (1) 利用抗生素抗性标志筛选 (2) 利用基因的插入失活/插入表达 特性筛选 (3) 利用标志补救筛选 (4) 利用噬菌体的包装特性进行筛选2. 序列特异性筛选 (1) RE酶切法 (2) PCR法 (3) 核酸杂交法 (4) DNA测序法：最准确 3. 亲和筛选法
• 重组DNA技术在医学中的应用
  • 一、重组DNA技术用于生物制药 例如•重组人胰岛素、干扰素等 •重组HBV、HPV、VLP疫苗 •人源化单克隆抗体，如赫赛汀
  • 二、研究、技重术平组台DNA技术是医学研究的重要技术平台 例如， •人类疾病动物模型 如：癌症，糖尿病，老化症等 遗传修饰猪——从猪到人的器官移植 •遗传修饰细胞模型 如：疾病的替代治疗/靶向治疗——CAR-T 体内示踪——GFP发光示踪 •发现基因新功能或新基因
  • 三、重组DNA技术是基因及其表达产物研究的技术基础 1. 在基因组水平上干预基因 ——传统的基因敲除 ——条件性基因打靶 ——基因组编辑 2.在RNA水平上干预基因的功能 ——RNA干涉 3. 研究蛋白质的相互作用 ——酵母双杂交系统 质粒载体 pCMV Cas9 Cas 9 基因组编辑 p