微生物的遗传变异和育种

微生物的遗传变异和育种思维导图，包括模式生物特性、遗传变异的物质基础、基因突变和诱变育种、基因重组和杂交育种等内容。

微生物的遗传变异和育种

• 前言
  • 遗传型：又称基因型，指某一生物个体所含有的全部遗传因子即基因组所携带的遗传信息
  • 表型：指某一生物体所具有的一切外表特征和内在特性的总和，是其遗传型在合适环境条件下通过代谢和发育而得到的具体提现
  • 变异：指生物体在某种外因或内因的作用下所引起的遗传物质结构或数量的改变
  • 饰变：指外表的修饰性改变，即一种不涉及遗传物质结构或数量的改变而只发生在转录、翻译水平上的表型变化
  • 模式生物特性
    • 物种与代谢类型的多样性
    • 个体的体制及其简单
    • 营养体一般都是单倍体
    • 易于在成分简单明确的组合培养基上大量生长繁殖
    • 繁殖速度快
    • 易于积累不同的中间代谢产物
    • 菌落形态的可见性与多样性
    • 环境条件对微生物群体中各个体作用的直接性和均一性
    • 易于形成营养缺陷型突变株和抗药性突变株
    • 10.各种微生物一般都有其相应的病毒
    • 11.存在多种处于进化过程中，富有特色的原始有性生殖方式
• 遗传变异的物质基础
  • 三个经典实验
    • 经典转化实验
      • 最早的转化实验以肺炎链球菌作为研究对象，可使人患肺炎，也可导致小鼠患败血症而亡
      • 菌株类型
        • S型：菌体具有荚膜，菌落表面光滑，有致病能力
        • R型：菌体无荚膜，菌落表面粗糙，无致病能力
      • 动物实验
        • 小鼠（活）
          • 加入活的R菌或加热杀死的S菌
            • 小鼠活
          • 加入活的S菌
            • 小鼠死
          • 加入活的R菌和加热杀死的S菌
            • 小鼠死
              • 抽心血分离→活的S菌
      • 细菌培养实验
        • 肺炎链球菌
          • 加热杀死的S菌
            • 培养皿培养
              • 不生长
          • 活的R菌
            • 培养皿培养
              • 长出R菌
          • 加热杀死的S菌+活的R菌
            • 培养皿培养
              • 长出大量R菌+10-6S菌
      • S型菌的无细胞抽提液实验
        • 活的R菌+S菌的无细胞抽提液
          • 培养皿培养
            • 长出大量R菌和少量S菌
        • 活的R菌
          • 加S菌的DNA
          • 加S菌的DNA及DNA酶以外的酶
          • 只长S菌
          • 加S菌的DNA和DNA酶
          • 加S菌的RNA
          • 加S菌的蛋白质
          • 加S菌的荚膜多糖
          • 只长R菌
      • 结论：加热杀死的S菌，在其细胞内可能存在一种转化物质，它能通过某种方式进入R型细胞并使R型细胞获得稳定的遗传性状
    • 噬菌体感染实验
      • 结论：在噬菌体的DNA 中，存在着包括合成蛋白质外壳在内的整套遗传物质
    • 植物病毒重建实验
      • 结论：核酸是遗传信息的载体
  • 遗传物质在微生物细胞内存在的部位和形式
    • 7个水平
      • 细胞水平：在细胞水平上，真核微生物和原核微生物的大部分DNA都集中在细胞核或核区中
      • 细胞核水平：不论真核生物的细胞核或原核生物细胞的核区都是该微生物遗传信息的最主要负荷者，被称为核基因组、核染色体组或基因组
      • 染色体水平
        • 染色体数：不同生物的染色体数差别很大
        • 染色体倍数：指同一细胞中相同染色体的套数
      • 核酸水平
        • 核酸种类
          • DNA
          • RNA
        • 核酸结构
          • 单链
          • 双链
        • DNA长度：即基因组的大小
      • 基因水平
        • 基因：基因是生物体内遗传信息的基本单位，通常指位于染色体上的一段以直线排列的核苷酸序列，它具有编码一特定功能的多肽、蛋白质或RNA(rRNA,tRNA)的功能
        • 基因调控系统
          • 操纵子
            • 启动基因
            • 操纵基因
            • 结构基因
          • 调节基因
      • 密码子水平：遗传密码是指DNA链上决定各具体氨基酸的特定核苷酸序列。遗传密码的信息单位是密码子，每一密码子由三个核苷酸序列即一个三联体所组成。
      • 核苷酸水平：在绝大多数生物的DNA组分中，都只含腺苷酸，胸苷酸，鸟苷酸和胞苷酸，四种脱氧核苷酸
    • 原核生物的质粒
      • 定义：凡游离于原核生物和基因组以外，具有独立复制能力的小型共价闭合环状的dsDNA分子，即cccDNA，就是典型的质粒
      • 特点：质粒具有麻花状的超螺旋结构，是一种独立存在于细胞内的复制子
      • 质粒在基因工程中的应用
        • 质粒具有许多有利于基因工程操作的优点
        • 分子量小，便于DNA的分离和操作
        • 呈环状，使其在化学分离过程中能保持性能稳定
        • 有不受核基因组控制的独立复制起始点
        • 拷贝数多，使外源DNA可很快扩增
        • 存在抗药性基因的选择性标记，便于含质粒克隆的检出和选择
      • 质粒的分离与鉴定：质粒的分离一般可包括细胞的裂解、蛋白质和RNA的去除，以及设法使质粒DNA与染色体DNA相分离等步骤
      • 质粒的种类
        • 结合质粒
        • 抗药质粒：抗各种抗生素，抗重金属等离子
        • 产细菌素和抗生素质粒
        • 具生理功能的质粒
        • 产毒质粒
      • 典型质粒简介
        • F质粒：又称F因子，致育因子或性因子
        • R质粒：又称R因子或抗性因子
        • Col质粒
        • Ti质粒
        • Ri质粒
        • mega质粒
        • 降解性质粒
        • 生理功能性质粒
• 基因突变和诱变育种
  • 基因突变
    • 定义：基因突变简称突变，是变异的一类，泛指细胞内遗传物质的分子结构或数量突然发生的可遗传的变化，可自发或诱导产生
    • 突变类型
      • 凡能用选择培养基，快速选择出来的突变株称选择性突变株，反之则称为非选择性突变株
      • 突变株的表型
        • 选择性突变株
          • 营养缺陷型
          • 抗性突变型
          • 条件致死突变型
        • 非选择性突变株
          • 形态突变型
          • 抗原突变型
          • 产量突变型
    • 突变率：某一细胞在每一世代中发生某一性状突变的概率称突变率
    • 基因突变的特点
      • 自发性
      • 不对应性
      • 稀有性
      • 独立性
      • 可诱变性
      • 稳定性
      • 可逆性
    • 基因突变自发性和不对应性的实验证明
      • 变量试验
      • 涂布试验
      • 影印平板试验
    • 基因突变及其机制
      • 基因突变的机制是多样性的，可以是自发的或诱发的，诱发的有可能会发生一对碱基的点突变和影响一段染色体的畸变
      • 基因突变
        • 诱变
          • 点突变
            • 碱基置换
              • 转换
              • 颠换
            • 移码突变
              • 缺失
              • 添加
          • 畸变
            • 缺失
            • 添加
              • 重复
              • 插入
            • 易位（转座）
            • 倒位
        • 自发突变
      • 诱发突变
        • 诱发突变简称诱变，是指通过人为的方法，利用物理化学或生物因素，显著提高基因自发突变频率的手段。
        • 类型
          • 碱基的置换
            • 直接引起置换的诱变剂：一类可直接与核酸的碱基发生化学反应的化学元素，在体内或离体条件下均有作用。
            • 间接引起置换的诱变剂：一些碱基类似物，通过活细胞的代谢活动参入到DNA分子中而引起的。
          • 移码突变：指诱变剂会使DNA序列中的一个或少数几个核苷酸发生增添或缺失，从而使该处后面的全部遗传密码的阅读框架发生改变，并进一步引起转录和翻译错误的一类突变
          • 染色体畸变：某些强力理化因子，如电离辐射和烷化剂亚硝酸等除了能引起上述的点突变外，还会引起DNA分子的大损伤染色体畸变及包括染色体结构上的缺失，重复插入易位和倒位也包括染色体数目的变化。
      • 自发突变
        • 生物体在无人工干预下自然发生的低频率突变
        • 原因
          • 由背景辐射和环境因素引起，例如天然的宇宙射线
          • 由微生物自身有害代谢产物引起例如过氧化氢
          • 由DNA复制过程中碱基配对错误引起
          • 由转座因子引起的插入或缺失，可诱导自发突变
    • 紫外线对DNA的损伤及其修复
      • 光复活作用：把经UV照射后的微生物立即暴露于可见光下时，却可出现明显降低其死亡率的现象，此即光复活作用。
      • 切除修复：是活细胞内一种对于被UV等诱变剂损伤后DNA的修复方式之一又称暗修复，这是一种不依赖可见光，只通过酶切作用去除嘧啶二聚体，随后重新合成一段正常DNA链的核酸修复方式。
  • 突变与育种
    • 自发突变与育种
      • 从生产中育种：在利用微生物进行大生产的过程中，微生物必然会以10的-6次方左右的突变率进行自发突变，其中有可能出现一定概率的正突变株
      • 定向培育优良菌株：定向培育是一种利用微生物的自发突变，并采用特定的选择条件，通过对微生物群体不断移植，以选育出比较优良菌株的古老方法。
    • 诱变育种
      • 诱变育种是指利用物理化学等诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞菌，在促进其突变率显著提高的基础上，采用简便快速和高效的筛选方法，从中挑选出少数复合目的的突变中一共科学实验和生产实践使用
      • 诱变育种的基本环节
        • 出发菌株
          • 诱变
            • 绝大多数个体死亡
            • 少数存活
              • 多数未突变
              • 少数突变
                • 多数负变
                • 少数正变
                  • 多数突变幅度小
                  • 少数突变幅度大
                    • 多数不宜投产
                    • 少数适宜投产
      • 诱变育种中的几个原则
        • 选择简便有效的诱变剂
          • 由于一切生物的遗传物质都是核酸，尤其是DNA，所以凡能改变核酸结构的因素都可以影响核酸的生物学功能。
          • 例：艾姆斯试验
            • 艾姆斯试验是一种利用细菌营养缺陷型的回复突变来检测环境或食品中是否存在化学制剂的简便有效方法。
            • 鼠伤寒沙门氏菌的组氨酸营养缺陷型菌株在基本培养基的平板上不能生长，如发生回复突变变成原养型，后则能生长。在含待测可以三致物例如黄曲霉毒素、二甲氨基偶氮苯、反应停或二噁英等的试样中加入鼠肝匀浆液，经一段时间保温后，吸入滤纸片中，然后将滤纸片放置于上述平板中央。
            • 经培养后出现三种情况
              • 在平板上无大量菌落产生，说明试样中不含诱变剂
              • 在纸片周围有一个抑制圈，其外周出现大量菌落，说明试样中有某种高浓度的诱变剂存在
              • 在纸片周围长有大量菌落，说明试样中有浓度适当的诱变剂存在
        • 挑选优良的出发菌株
          • 出发菌株：初发菌株就是用于育种的原始菌株，选用合适的出发菌株，有利于提高育种效率。
          • 最好选用来自生产中的自发突变菌株
          • 选用具有有利于进一步研究或应用性状的菌株，如生长快，营养要求低等
          • 可选用已发生过其他突变的菌株
          • 选用对诱变剂敏感性较高的增变变异株
        • 处理单细胞或单胞子悬液：为使每个细胞均匀接触诱变剂并防止长出不纯菌落，就要求做诱变的菌株，必须以均匀而分散的单细胞悬液状态存在。
        • 选用最适的诱变剂量
          • 各类诱变剂剂量的表示方式有所不同，在产量性状的诱变育种中，凡再提高诱变率的基础上，既能扩大变异幅度，又能促使变异移向正变范围的剂量就是合适的剂量。
          • 诱变育种中的两条重要的实验曲线
            • 剂量存活率曲线：以诱变剂的剂量为横坐标，以细胞存活数的对数值为纵坐标绘制的曲线。
            • 剂量-诱变率曲线：以诱变剂的剂量为横坐标，以诱变后获得的突变细胞数为纵坐标绘制成的曲线
        • 充分利用复合处理的协同效应：诱变剂的复合处理常常表现出明显的协同效应，因而对育种有利。
        • 利用和创造形态、生理与产量间的相关指标
        • 设计高效筛选方法
        • 创造新型高效筛选方法
      • 三类突变株的筛选方法
        • 产量突变株的筛选
          • 负选择标记
        • 抗药性突变株的筛选
          • 正选择标记
        • 营养缺陷型突变株的筛选
          • 在选择培养基上不生长
          • 与筛选营养缺陷型突变株有关的培养基
            • 基本培养基
            • 完全培养基
            • 补充培养基
          • 与营养缺陷型突变有关的遗传型个体
            • 野生型
            • 营养缺陷型
            • 原养型
          • 营养缺陷型的筛选方法一般要经过诱变、淘汰野生型、检出和鉴定营养缺陷型4个环节
        • 平皿快速检测法
          • 变色圈法
          • 透明圈法
          • 生长圈法
          • 抑菌圈法
          • 梯度平板法
          • 影印平板
• 基因重组和杂交育种
  • 两个独立基因组内的遗传基因，通过一定的途径转移到一起，形成新的稳定基因组的过程，称为基因重组或遗传重组简称重组。
  • 原核生物的基因重组
    • 特点
      • 片段性：仅一小段DNA序列参与重组
      • 单向性：即从供体菌向受体菌作单方向转移
      • 多样性：即转移机制独特而多样，如接合、转化和转导等
    • 转化
      • 定义：受体菌直接吸收供体菌的DNA片段，而获得后者部分遗传性状的现象，称为转化或转化作用，通过转化方式而形成的杂种后代称转化子
      • 转化微生物的种类：转化为生物的种类十分普遍。有些真菌在制成原生质体后也可实现转化
      • 感受态：感受态是指受体细胞最易接受外源DNA片段，并能实现转化的一种生理状态
      • 转化因子：转化因子的本质是离体的DNA片段
      • 转化过程
        • 供体菌的dsDNA片段与感受态受体菌细胞表面的膜连DNA结合蛋白相结合，其中一条链被核酸酶切开和水解另一条进入细胞。
        • 来自供体菌的ssDNA片段与细胞内的感受态特异的ssDNA结合蛋白相结合，并使ssDNA进入细胞，随即在RecA蛋白的介导下与受体J菌核染色体上的同源区段配对、重组，形成一小段杂合DNA区段
        • 受体菌染色体组进行复制于是杂合区也同时得到复制
        • 细胞分裂后形成一个转化子和一个任保持受体菌原来基因型的子代
      • 转染：指用提纯的病毒核酸去感染其宿主细胞或原生质体，可增值出一群正常病毒后代的现象
    • 转导
      • 通过缺陷噬菌体的媒介，把供体细胞中的小片段DNA携带到受体细胞中，通过交换与整合使后者获得前者部分遗传性状的现象称为转导
      • 普遍转导
        • 通过极少数完全缺陷，噬菌体对供体菌基因组上任何小片段，DNA进行误包，而将其遗传性状传递给受体菌的现象，称为普遍传导。
        • 完全普遍转导：进入受体的外源DNA，通过与细胞染色体的重组交换而形成稳定的转导子，在选择培养基上形成正常菌落。
        • 流产普遍转导：经转导噬菌体的媒介而获得了供体菌DNA片段的受体菌，如果这段外源DNA在其内既不进行交换整合和复制，也不迅速消失，而仅表现稳定的转录翻译和性状表达这一现象就称流产传导。
      • 局限转导
        • 温和噬菌体感染
        • 整合到细菌染色体的特定位点上，宿主细胞发生溶原化。
        • 溶源菌因诱导而发生裂解时，在前噬菌体二侧的少数宿主基因，因偶尔发生的不正常切割，而连在噬菌体DNA上。
        • 部分缺陷的温和噬菌体
        • 把供体菌的少数特定基因转移到受体菌中
    • 接合
      • 细菌的接合作用：通过性菌毛使细胞与细胞的直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程。
      • E.coli的4种结合型菌株
        • F⁺菌株：即雄性菌株指细胞内存在一至几个F质粒，并在细胞表面产生一至几条性菌毛的菌株
        • F⁻菌株：即雌性菌株，指与F⁺菌株相对应的、细胞中无F质粒、细胞表面也无性菌毛的菌株
        • HFr菌株：高频重组菌株， F质粒已从游离态，转变成在核染色体组特定位点上的整合态
        • F′菌株：当Hfr菌株细胞内的F质粒应不正常切离而脱离和染色体组时，可重新形成游离的、但携带整合位点邻近一小段核染色体基因的特殊F质粒
    • 原生质体融合
      • 通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程，称为原生质体融合
      • 操作步骤
        • 选择两株有特殊价值并带有选择性遗传标记的细胞作为亲本菌株，置于高渗溶液中
        • 适当的脱壁酶去除细胞壁形成原生质体
        • 将形成的原生质体进行离心聚集，加入促融合剂PEG或借助电脉冲等因素促进融合
        • 用等渗溶液稀释，再涂在能使它再生细胞壁和进行细胞分裂的基本培养基平板上
        • 待形成菌落后，再通过影印平板法把它接种到各种选择培养基平板上，检验它们是否为稳定的融合子
        • 测定其有关生物学性状或生产性能
  • 真核微生物的基因组重组
    • 有性杂交
      • 杂交是指在细胞水平上进行的一种遗传重组方式。有性杂交，一般指不同遗传性的两性细胞间发生的结合和随之进行的染色体重组，进而产生新遗传型后代的一种育种技术。
    • 准性杂交
      • 准性生殖
        • 定义：在自然条件下，真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合的现象
        • 准性生殖过程
          • 菌丝联结
          • 形成异核体
          • 核融合
          • 体细胞交换和单倍体化
      • 准性杂交育种
        • 准性生殖，对于一些没有有性生殖过程，但有重要生产价值的半知菌类育种工作来说，提供了一个杂交育种的手段。
        • 过程
          • 选择亲本：选择来自不同菌株的合适的营养缺陷型作为准性杂交的亲本
          • 强制异合：用人为的方法强制两个营养缺陷型的亲本菌株形成互补的异核体
          • 移单菌落：将平板上长出的单菌落移种到基本培养基的斜面上
          • 验稳定性：设法检验获得的菌株究竟是一种不稳定的异核体，还是稳定的杂合二倍体
          • 促进变异： 把上述稳定菌株所产生的分生孢子，用紫外线，γ射线等理化因子进行处理，以促使其发生染色体交换，染色体在子细胞中分配不均，染色体缺失或畸变以及发生点突变等变化，从而使分离后的杂交子代进一步增加新形状变异的可能性
          • 选出良种
• 菌种的衰退、复壮和保藏
  • 菌种的衰退与复壮
    • 衰退
      • 衰退是指某纯种微生物群体中的个别个体由于发生自发突变，而使该物种原有的一系列生物学性状发生衰退的量变或质变的现象
      • 具体表现
        • 原有形态性状变得不典型了
        • 生长速度变慢，产生的孢子变少
        • 代谢产物生产能力下降
        • 致病菌对宿主侵染力的下降
        • 对外界不良条件包括低温高温或噬菌体侵染等抵抗力下降
      • 衰退的防止
        • 控制传代次数
        • 创造良好的培养条件
        • 利用不易衰退的细胞传代
        • 采用有效的菌种保藏方法
    • 复壮
      • 狭义的复壮仅是一种消极的措施，指的是在菌群已发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定典型性状生产性能等指标，从已衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有的性状的相应措施。
      • 广义的复壮则应是一项积极的措施，即在菌种的典型特征和生产形状尚未衰退前，就经常有意识地采取纯种分类和生产性状的测定工作，以其从中选择到自发的正变个体
      • 菌种的复壮
        • 纯种分离法
          • 菌落纯
            • 平板表面涂布法
            • 平板划线分离法
            • 琼脂培养基浇注法
          • 细胞纯
            • 用分离小室进行单细胞分离
            • 用显微操作器进行单细胞分离
            • 用菌丝尖端切割法进行单细胞分离
            • 用激光镊子技术从毛细管中分离
        • 通过宿主体内复壮
        • 淘汰已衰退的个体
  • 菌种的保藏
    • 生活态——传代培养保藏法
      • 连续在培养基上移种
      • 连续在活宿主上移种
    • 休眠态
      • 干法
        • 藏在玻璃管内
          • 滴入小试管（再放入大试管干燥器中）
          • 封入安瓿
            • 菌液直接真空干燥法
            • 冷冻真空干燥法，液氮保藏法
        • 吸附在合适的载体上
          • 细粒状载体
            • 土壤
            • 砂砾
            • 土壤+砂砾（砂土保藏法）
          • 球块状载体
            • 硅胶
            • 瓷球
          • 薄片状载体
            • 滤纸片
            • 明胶小片（滴在蜡纸板上干燥而成）
            • 血清蛋白小片（滴在聚乙烯薄膜上干燥而成）
          • 有机基质
            • 曲料
            • 麦粒
            • 棉纤维
      • 湿法
        • 固体斜面
        • 半固体琼脂柱
        • 液体介质
          • 蒸馏水
          • 甘油（约40％）（甘油保藏法）
          • 糖液
          • 其他悬液
• 基因工程
  • 基因工程的定义：基因工程又称遗传工程，是指人们利用分子生物学的理论和技术，自觉设计、操纵、改造和重建细胞的遗传核心——基因组，从而使生物体的遗传性状发生定向变异，以最大限度地满足人类活动的需要。
  • 基因工程的基本操作
    • 目的基因的获取
    • 优良载体的选择
    • 目的基因与载体DNA的体外重组
    • 重组载体导入受体细胞
    • 重组受体细胞的筛选和鉴定
    • 工程菌或工程细胞的大规模培养
  • 基因工程的应用
    • 生产多肽类药物、疫苗
    • 改造传统工业发酵菌种
    • 动、植物特性的基因工程改良
      • 转抗病虫害基因
      • 利用嗜极菌的特殊功能基因，用于抗逆境植物品种的培育
      • 高产、优质品种的培育