生物素-亲和素放大技术

生物素-亲和素放大技术思维导图，包括生物素的理化性质与标记、生物素-亲和素系统的应用，亲和素、链霉亲和素的理化性质与标记，生物素-亲和素系统的特点等。

生 物 素 | 亲 和 素 放 大 技 术

• 生物素的理化性质与标记
  • 生物素（biotin，B）广泛分布于动、植物组织中，常从含量较高的卵黄和肝组织中提取，分子量244.31kD。
  • 活化生物素
    • 2.生物素脱氧核苷三磷酸：将生物素与某种脱氧核苷酸连接成活化生物素。用缺口移位法掺入到双链DNA中。
    • （四）标记核酸的活化生物素：生物素戊酸侧链通过酰胺键与核酸分子相连，构成生物素标记的核酸探针。
    • （二）标记蛋白质醛基的活化生物素有两种：生物素酰肼（BHZ）和肼化生物胞素（BGHZ）。
    • （三）标记蛋白质巯基的活化生物素：3-（N-马来酰亚胺-丙酰）-生物胞素（MPB）。
    • 利用生物素的羧基加以化学修饰可制成各种活性基团的衍生物，称为活化生物素
    • 3.BNHS和BHZ：与核酸胞嘧啶分子中的N-4氨基交联，使核酸分子生物素化。
    • 1.光敏生物素：用于DNA或RNA的标记。
    • （一）标记蛋白质氨基的活化生物素
  • 生物素标记蛋白质
    • 标记注意事项
      • 1.应根据抗原或抗体分子结构中所带可标记基团的种类（氨基、醛基或巯基）以及分子的理化性质（酸性、中性或碱性），选择相应的活化生物素和反应条件。
      • 2.标记反应时，活化生物素与待标记抗原或抗体应有适当的比例，使每个蛋白质分子上标记的生物素分子数量控制在一定范围，以免影响标记物的活性。
      • 3.为减少生物素标记蛋白质后，大分子物质造成的空间位阻影响，有利于生物素与亲和素的结合，可在生物素与被标记物间加入交联臂样结构。
      • 4.生物素与抗原、抗体等蛋白质结合后，不影响后者的免疫活性；标记酶时则结果有不同。
    • 标记方法
      • 标记抗体、抗原：由于一个抗体分子可连接多个生物素分子，因此一个生物素化的抗体分子在反应时可与多个亲和素分子结合。通常选用第二抗体进行生物素标记，制备的标记物具有通用性。
      • 标记酶：如生物素标记辣根过氧化物酶（HRP）。
    • 衍生物的特性
      • 生物素化的大分子活性物质（如抗原、抗体）
      • 标记材料（如酶）结合生物素后制成的标记物
• 生物素-亲和素系统的应用
  • 生物素-亲和素系统基本类型及原理
    • 以游离亲和素为中间物，分别连接包含生物素化大分子的待检反应体系和标记生物素，称为BAB法；后又发展了亲和素-生物素化酶复合物技术（ABC）。
    • 直接用标记亲和素连接生物素化大分子反应体系进行检测的BA法，或称标记亲和素-生物素法（LAB）。
  • 生物素-亲和素系统在酶免疫测定中的应用
    • 将BAS与ELISA偶联可提高ELISA的灵敏度：每个亲和素可结合4个生物素，可使反应明显放大；亲和素与生物素间极高的亲和力，使反应结合更牢固稳定，而且特异性高；用小分子生物素代替酶标记抗体，可减少反应中的空间位阻。
    • 生物素-亲和素系统可作为均相酶免疫测定中高效的酶活性调变系统。
  • 生物素-亲和素系统在荧光免疫技术中的应用
    • 通常采用BA法，即用荧光素直接标记亲和素（或链霉亲和素）
    • 也可采用游离亲和素（或链霉亲和素）搭桥，两端分别连接生物素化抗体和荧光素标记的生物素（BAB法）或荧光标记的抗亲和素（或链霉亲和素）抗体的夹心法
  • 生物素-亲和素系统在放射免疫测定中的应用
    • BAS主要与免疫放射分析（IRMA）检测体系偶联，用于对终反应的放大（BA法）。
    • 该法的优点是克服了其他IRMA法需多次离心的麻烦，待测复合物与固相结合更牢固，操作更简便
    • 也可用于IRMA反应后B，F成分的分离
  • 生物素-亲和素系统在分子生物学中的应用
    • 3.将免疫测定技术与PCR结合建立免疫-PCR用于抗原的检测
    • 2.用BAS制备的亲和吸附剂进行基因的分离纯化
    • 1.以生物素标记核酸探针进行的定位检测
• 亲和素、链霉亲和素的理化性质与标记
  • 亲和素（或链霉亲和素）的标记
    • 最常用的是酶、异硫氰酸荧光素（FITC）和胶体金
    • 制备亲和素（或链霉亲和素）与常用酶形成标记结合物的方法
      • 亲和素的标记
        • 3.亲和素-生物素化碱性磷酸酶（ABAP）复合物的制备
        • 1.HRP-亲和素结合物的制备
          • （1）改良过碘酸钠法
          • （2）戊二醛法
        • 2.亲和素-生物素化HRP复合物的制备
      • 链霉亲和素的标记
        • 1.HRP-SA结合物的制备 采用过碘酸钠法直接标记。
        • 3.AP-SA结合物的制备 采用戊二醛二步法。
        • 2.SA-生物素化HRP复合物的制备。
  • 链霉亲和素及其活性
    • 链霉亲和素（SA）是由链霉菌streptomyces avidinii分泌的一种蛋白质，分子量为65kD。
    • 链霉亲和素（SA）分子中每条肽链都能结合一个生物素，因此一个链霉亲和素分子也能结合4个生物素分子。
  • 亲和素及其活性
    • 亲和素（AV）耐热并耐受多种蛋白水解酶的作用，尤其是与生物素结合后，稳定性更好。
    • 每个亲和素能结合4个分子的生物素，二者之间的亲和力极强。
  • 亲和素和链霉亲和素是大分子蛋白，几乎可以和任何用于标记的物质结合。
• 生物素-亲和素系统的特点
  • 二、特异性：亲和素与生物素间的结合具有极高的亲和力，其反应呈高度专一性。而且，BAS结合特性不会因反应试剂的高度稀释而受影响，使其在实际应用中可最大限度地降低反应试剂的非特异作用。
  • 五、其他：BAS可依据具体实验方法要求制成多种通用性试剂（如生物素化第二抗体等），适用于不同的反应体系；而且都可高度稀释，用量很少，实验成本低；尤其是BAS与成本高昂的抗原特异性第一抗体偶联使用，可使后者的用量大幅度减少，节约实验费用。此外，由于生物素与亲和素的结合具高速、高效的特性，尽管BAS的反应层次较多，但所需的温育时间不长，实验往往只需数小时即可完成。
  • 四、适用性：生物素和亲和素可与酶、荧光素和放射性核素等各类标记技术结合，用于检测体液、组织或细胞中的抗原-抗体、激素-受体和核酸系统以及其他多种生物学反应体系；而且也可制成亲和介质，用于分离提纯上述各反应体系中的反应物。
  • 三、稳定性：亲和素与生物素间的亲和常数极高，结合形成的复合物的解离常数很小，呈不可逆反应性；而且酸、碱、变性剂等均不影响其结合。
  • 一、灵敏度：每个亲和素分子有四个生物素结合部位，因此，BAS具有多级放大作用，使其在应用时可极大地提高检测方法的灵敏度。