中药化学成分的一般研究方法

中药化学（匡海学）的后半部分，郭力的中化书是第二章节，中药化学成分的一般研究方法，包括中药有效成分的简介和合成途径，提取分离精制，色谱检识等内容

中药化学成分及生物合成简介

• 各类成分简介
  • 糖类化合物
    • 单糖
      • 结构特点：单分子、无色结晶
      • 溶解性：易溶于水，难溶于无水乙醇
    • 低聚糖
      • 结构特点：2-9个单糖脱水缩合而成
      • 溶解性：易溶于水，难溶或不溶于乙醇等有机溶剂→含有低聚糖的水提液中加入乙醇会析出沉淀
    • 多糖
      • 结构特点：10个以上单糖脱水缩合而成高聚物（→已经失去一般糖的性质），没有甜味
      • 溶解性：大都不溶于水，即使溶了也只是生成胶体溶液
        • 一般难溶于60%以上的乙醇及其他有机溶剂
  • 苷类化合物
    • 糖—X—苷元
      • 苷键原子：X=O，N，S或C等
    • 结构特征：是糖或糖的衍生物与非糖物质（称为苷元或配基）通过糖的端基碳原子连接而成的
    • 溶解性
      • 苷：能溶于水，可溶于乙醇、甲醇，难溶于乙醚或苯中，有些苷可溶于乙酸乙酯、氯仿中
      • 苷元：大多难溶于水，可溶于乙醛、甲醇、溶于有机溶剂
  • 醌类化合物
    • 主要性质
      • 分子中具有醌式结构的化合物
      • 分子中多具酚羟基，有一定的酸性
    • 溶解性
      • 游离：多溶于乙醇，氯仿等有机溶剂，微溶或难溶于水
      • 成苷：极性增大，易溶于甲醇，乙醇中，可溶于热水
  • 苯丙素类化合物
    • 以C₆-C₃为基本骨架
    • 以简单苯丙素：结构上属苯丙烷衍生物，依C₃侧链的结构变化，可分为苯丙烯，苯丙醇，苯丙醛等
    • 香豆素
      • 一类具有苯骈α—吡喃酮母核的天然化合物的总称
      • 结构特征：由顺式邻羟基桂皮酸脱水形式的内酯，在稀碱溶液中可水解开环，生成顺式邻羟基桂皮酸的盐，加酸后可环合成为原来的内酯
      • 溶解性
        • 游离：溶于沸水，甲醇，乙醇和乙醚
        • 苷类：溶于水，甲醇，乙醇
    • 木脂素
      • 结构特征：两分子苯丙素衍生物聚合而成的天然化合物
      • 溶解性
        • 游离：亲脂性，难溶于水，能溶于苯，氯仿，乙醚，乙醇等
        • 木脂素苷类：水溶性增大
  • 黄酮类化合物
    • 泛指有两个苯环通过中间三碳链相互连接而成的一类化合物
    • 主要性质
      • 母核结构：C₆—C₃—C₆
      • 大多具酚羟基，显酸性
    • 溶解性
      • 游离：易溶于甲醇，乙醇，乙酸乙酯，乙醚等有机溶剂，及稀碱溶液中
      • 黄酮苷：易溶于水，甲醇，乙醇，吡啶等极性溶剂
  • 萜类和挥发油
    • 萜类
      • 凡由甲戊二羟酸衍生，且基本母核的分子式符合（C₅H₈）ₙ通式的衍生物为萜类化合物
      • 结构特征：基本母核：（C₅H₈）ₙ
      • 主要性质：单萜和倍半萜具挥发性；二萜和二倍半萜一般结晶
      • 溶解性
        • 游离萜类：亲脂性，难溶于水
        • 单萜和倍半萜：水蒸气蒸馏
        • 内酯结构的萜类：溶于碱水，酸化后，又从水中析出
        • 苷化后具有一定的亲水性
    • 挥发油
      • 是一类可随水蒸气蒸馏，与水不相混溶的油状液体物质
      • 主要性质：挥发油为无色的淡黄色的透明油状液体，具芳香味，常温下能挥发，有较强的折光性和旋光性
      • 组成：复杂（萜类和芳香族化合物以及它们的含氧衍生物）
      • 溶解性：脂溶性。易溶于大多数有机溶剂中，如：乙醚，苯。石油醚，乙醇等
  • 生物碱
    • 是一类存在于生物体内的含氮有机化合物，具有碱性，能与酸结合成盐
    • 结构特征：含氮有机化合物
    • 主要性质：碱的性质——与酸结合成盐
    • 溶解性
      • 游离：不溶或难溶于水，能溶于乙醇、氯仿、丙酮、乙醇和苯等有机溶剂
      • 生物碱盐尤其是无机酸盐和小分子有机酸盐则易溶于水及乙醇，不溶或难溶于常见有机溶剂
  • 甾体类化合物
    • 是一类结构中具有环戊烷骈多氢菲甾核化合物
    • 结构特征：母核：环戊烷骈多氢菲甾核
    • 主要性质：水溶性多具发泡性，溶血性及鱼毒性
    • 溶解性
      • 苷元：亲脂性溶剂如石油醚，氯仿等，而不溶于水
      • 甾体皂苷：一般可溶于水，易溶于热水，稀醇。不溶或难溶于石油醚，苯，乙醚等亲脂性溶剂
  • 三萜类化合物
    • 是一类基本骨架由30个碳原子组成的萜类化合物
    • 结构特征：母核：30个碳原子组成的萜类化合物
    • 主要性质：水溶液亦多具发泡性，溶血性及鱼毒性
    • 溶解性
      • 苷元：能溶于亲脂性溶剂，不溶于水
      • 三萜皂苷难溶于乙醚，石油醚等溶剂，可溶于水，易溶于热水，稀醇，热甲醇和热乙醇中，含水丁醇或戊醇对皂苷的溶解度较大，常作为提取皂苷的溶剂
  • 鞣质
    • 又称单宁或鞣酸，是由没食子酸（或其聚合物）的葡萄糖（及其多元醇）酯、黄烷醇及其衍生物的聚合物以及两者混合共同组成一类复杂的多元醇酚类化合物的总称
    • 主要性质
      • 可与蛋白质结合形成致密、柔韧、不易腐败又难透水的化合物
      • 其水溶液遇重金属盐如醋酸铅、醋酸铜等能产生沉淀，还能与蛋白质，多种生物碱盐类形成沉淀
    • 溶解性
      • 能溶于水，乙醇，丙酮，乙酸乙酯等极性大的溶剂，不溶于乙醚，氯仿，苯，石油醚等极性小的有机溶剂，可溶于乙醚和乙醇的混合溶液
• 各类中药化学成分的主要生物合成途径
  • 乙酸—丙二酸途径（AA-MA途径）:脂肪酸类、酚类、醌类等
  • 甲戊二羟酸途径（MVA途径）：萜类、甾体类等
  • 莽草酸途径：苯丙素类、香豆素类、木脂素类等
  • 氨基酸途径：生物碱类
  • 复合途径：黄酮类等

提取

• 提取溶剂
  • 提取溶剂按极性由弱到强的顺序
    • 甲醇、乙醇、丙酮可与水任意比互溶 甲醇、乙醇、丙酮与亲脂性有机溶剂任意比互溶 甲醇与除石油醚外的其他亲脂性有机溶剂任意比互溶 正丁醇萃取水溶性成分
    • 亲脂性有机溶剂：石油醚<四氯化碳<苯<二氯甲烷<氯仿<乙醚<乙酸乙酯
    • 亲水性有机溶剂：正丁醇<丙酮<乙醇<乙醇<甲醇
    • 水：常水、酸水、碱水
  • 提取溶剂的选择（“相似相溶”）
    • 对所提取成分的溶解度要大，对杂质溶解度要小
    • 溶剂与所提取成分不发生意外反应；有目的的化学反应除外：酸水提取生物碱
    • 溶剂廉价，易得，安全（如不易燃、易爆、无毒）
  • 提取溶剂的特点
    • 水
      • 主要溶剂：常水、酸水、碱水
      • 用途：可提取亲水性强的中药成分
      • 优点：廉价易得，使用安全，在工业中广泛应用
      • 缺点：其水提液易霉变，不易保存，粘度大，过滤困难，浓缩时间长
    • 亲水性有机溶剂
      • 主要溶剂：甲醇、乙醇、丙酮等
      • 用途：溶解范围广，大部分中药化学成分均可提出
      • 优点：回收方便，毒性小，价格便宜，提取液不易发霉变质，提取苷类成分不易产生水解等
      • 缺点：甲醇毒性较大，使用受到限制
    • 亲脂性有机溶剂
      • 主要溶剂：苯、石油醚、氯仿、乙酸乙酯等
      • 用途：提取亲脂性有机溶剂
      • 优点：提取亲脂性成分时，水溶性杂质很少被提出
      • 缺点：易燃、有毒。价格昂贵，不易透入植物组织，提取时间长，用量大
• 提取方法
  • 常见的提取方法
    • 浸渍法
      • 特点：不加热冷浸（溶剂为水或稀醇）
      • 优点
        • 适用于不能加热的药材（加热成分被破坏）
        • 适用于淀粉或粘液质含量较多的中药成分提取
      • 缺点
        • 提取时间长，效率不高
        • 以水为提取溶剂时，应注意防止提取液发霉变质
    • 渗漉法
      • 特点
        • 溶剂是在动态中进行的
        • 溶剂从上至下流动，造成良好的浓度差，使扩散较好的进行
      • 优点
        • 适用于不能加热的药材（加热成分被破坏）
        • 适用于淀粉或粘液质含量较多的中药的成分提取
        • 提取效率高，不加热
      • 缺点：溶剂体积大，费时，操作较麻烦
    • 煎煮法
      • 特点
        • 可直火加热（现在多用夹层锅：温度较好控制，受热均匀）
        • 一定要用水作为煮溶剂
        • 时间主要通过实验来确定，一般0.5～1或2小时/每次，2～3次
      • 优点
        • 此法简便，中药的大多数成分可被不同程度地提取出来
        • 效率高
      • 缺点
        • 含挥发性成分及有效成分遇热易破坏不宜用此法
        • 含多糖类成分的药材煎煮后药液较粘稠不宜过滤
        • 苷类：易水解
    • 回流提取法
      • 特点
        • 以有机溶剂为溶媒（醇类，亲脂类）
        • 不允许用直火进行加热
        • 可用水浴或蒸汽进行加热
      • 优点：此法提取效率高于渗漉法
      • 缺点：成分易破坏，溶剂用量大
    • 连续回流提取法
      • 特点 ：以索氏提取器（亦称脂肪抽出器）回流提取
      • 优点：克服了回流法溶剂需要量大，需几次提取的缺点
      • 缺点：提取时间长，受热破坏成分不能用此法
  • 水蒸气蒸馏法
    • 提取具有挥发性，能随水蒸气蒸馏而不被破坏的成分，如挥发油
  • 升华法
    • 用于具有升华性的成分提取，如某些小分子香豆素，蒽醌，樟脑等
  • 超声提取法
    • 是利用超声波产生的强烈的空化效应，机械振动，高的加速度，乳化，扩散，击碎和搅拌作用，增大物质分子运动频率和速度，增加溶剂穿透力，从而加速药物有效成分进入溶剂，促进提取的进行
    • 特点
      • 提取效率高
      • 提取温度低
      • 提速时间短
      • 适应性广
      • 能耗少
      • 药液杂质少，有效成分易于分离、纯化
      • 简单易行，设备的维护和保养方便
  • 微波提取法
    • 利用不同组分吸收微波能力的差异，使基体物质的某些区域或提取体系中的某些组分被选择性加热，从而使得被提取物质从基体或体系中分离，进入到介电常数较小，微波吸收能力较差的提取剂中，并达到较高的产率
    • 特点
      • 优点：具有穿透力强，选择性高，加热效率高，试剂用量少等显著特点，而且其操作方便，快速，节能，高效
      • 缺点：工业化设备少，成分变化导致生物活性变化
  • 超临界流体提取法（SFE）
    • 特点
      • 主要适用于提取脂溶性成分
      • 超临界流体的密度与液体很接近，而它又具有气体扩散性能
      • 可在低温下提取，“热敏性”成分尤其适用
      • 无溶剂残留，对作为制剂的天然提取物的提取是一大优势
      • 提取与蒸馏合为一体，无需回收溶剂
        • 环保
      • 具选择性分离
      • 常用的临界流体有：CO₂，N₂O，乙烷，丙烷等
      • 如从烟草中提取尼古丁，从咖啡中提取咖啡因

中药有效成分的分离精制方法

• 中药组分分离研究的总体思路
  • 以中药复杂化学物质基础为研究目标
  • 以分离研究的系统性和整体性为原则
  • 以新型分离材料为标准组分系统表征为基础
  • 完成从药材到标准组分，再到单体化合物的研究
• 中药系统分离制备流程
  • 预处理
  • 粗分离
  • 精分离
• 经典分离方法
  • 溶剂萃取法
    • 特点
      • 利用中药总提取物中化学成分在不同极性溶剂中的溶解度不同，选用3，4种不同极性溶剂，由低极性到高极性分步进行分离
        • 最常用的方法
      • 常用溶剂的极性强弱顺序为：石油醚（低沸点→高沸点）<环己烷<四氯化碳<二氯乙烷<苯<甲苯<二氯甲烷<三氯甲烷<乙醚<乙酸乙酯<丙酮<正丁醇<乙醇<甲醇<水
        • 极性逐渐↑
    • 溶剂分配法
      • 特点：混合物中各成分在两相溶剂中分配系数相差越大，则分离效率越高
        • 溶剂极性小的成分选用氯仿（或乙醚）—水； 极性中等成分的分离选用乙酸乙酯—水； 极性较大的成分通常选用正丁醇—水
      • 溶剂选取极性从小到大
    • 酸碱溶剂法
      • 特点 ：利用混合物中各组分酸性或碱性的差异而进行分离
      • 规律
        • 生物碱类可与无机酸生成生物碱盐而溶于水，再加碱碱化，又重新生成游离生物碱
        • 具有羧基或酚羟基的酸性成分，难溶于酸水可与碱成盐而溶于水
        • 具有内酯结构或内酰胺结构的成分可被皂化溶于水，借此与其他难溶于水的成分分离
  • 沉淀法
    • 特点
      • 基于有些中药化学成分能与某些试剂生成沉淀，或加入某些试剂后可降低某些成分在溶液中的溶解度而自溶液中析出的一种方法
      • 是可以获得有效成分或除去杂质的初步分离方法
      • 如果将需要分离获得的成分生成沉淀，这种沉淀反应必须是可逆的
      • 如果是不需要的成分，则将生成的沉淀除去，故此时所应用的沉淀反应可是不可逆的
    • 专属试剂沉淀法
      • 利用某些试剂选择性地与某类化学成分反应生成可逆的沉淀而与其他成分分离
      • 例
        • 雷氏铵盐等生物碱沉淀试剂能与水溶性生物碱类生成沉淀，可用于分离生物碱与非生物碱类以及水溶性生物碱与其它生物碱的分离
        • 胆甾醇能与甾体皂苷生成沉淀，可可使其与三萜皂苷分离
        • 明胶能沉淀鞣质，可用于分离或除去鞣质
    • 分级沉淀法
      • 在混合组分的溶液中加入与该溶液能互溶的溶剂，改变是混合物组分溶液中某些成分的溶解度，使其从溶液中析出，改变加入溶剂的极性或数量而使沉淀逐步析出
      • 水提醇沉法中高浓度的醇可使多糖，蛋白质，淀粉，树胶，黏液质等沉淀下来，经过滤除去沉淀即可达到有效成分与这些杂质相分离的目的
      • 醇提水沉法分离，即先用一定浓度的乙醇提取，在醇提取浓缩液中加入10倍量以上的水，可沉淀亲脂性成分
  • 结晶法
    • 利用结晶法进行中药中化学成分的分离纯化，不需要用复杂的仪器设备，相对于制备色谱分离方法，成本低，适于大量制备
    • 结晶法的关键是选择合适的溶剂，要注意选择合适的溶剂和应用适量的溶剂。制备结晶溶液，除选用单一溶剂外，也常采用混合溶剂
    • 一般是先将化合物溶于易溶的溶剂中。再在室温下滴加适量的难溶的溶剂，直至溶液微呈浑浊，并将此溶液微微加温，使溶液完全澄清后放置
  • 经典色谱法
    • 特点
      • 利用混合样品中各成分在固定相和流动相中，不同的平衡分配系数进行分离的方法，是中药化学成分分离中最常应用的分离法
      • 分离效能高，快速简便
      • 色谱分离所用的固定相与流动相互不相溶。固定相只能是固体或液体，流动相只能是溶液或气体。以气体为流动相的称为气相色谱，液体流动相的称为液相色谱
    • 吸附色谱
      • 原理
        • 由于不同极性成分对吸附剂吸附能力不同，吸附力强的移动慢，吸附力弱的移动快
        • 由于洗脱剂对不同极性成分溶解能力不同，溶解度小的移动慢，溶解度大的移动快
      • 吸附剂
        • 硅胶
          • 具有多孔性的硅氧环（-Si-O-Si-）的铰链结构，其骨架表面的硅醇基（-SiOH）能通过氢键与极性或不饱和分子相互作用
          • 吸附规律
            • 弱酸性，极性吸附剂
            • 化合物极性越大，吸附能力强（难洗脱）
            • 溶剂极性越小，吸附力越强
          • 应用：使用最为广泛的一种色谱方法，适用范围广，中药各类化学成分大多均可用其进行分离
        • 氧化铝
          • 是一种常用的吸附能力较强的极性吸附剂。谱用氧化铝有碱性、中性和酸性三种
          • 吸附规律
            • 碱性，极性吸附剂
            • 化合物极性越大，吸附能力强（难洗脱）
            • 溶剂极性越小，吸附力越强
          • 应用：主要用于碱性或中性亲脂性成分的分离，对树脂，叶绿素及其他杂质的吸附能力较强，常用以提取物的预处理，去除杂质。便于以后的分离纯化
        • 活性炭
          • 是一种非极性吸附剂，其吸附能力与硅胶，氧化铝相反
          • 吸附规律
            • 化合物极性越大，吸附能力弱
            • 溶剂极性越小，吸附能力越弱
            • 活性炭的吸附能力在水溶液中最强，在有机溶剂中最弱
          • 应用：对非极性成分具有较强的亲和力，主要用来分离水溶性成分
        • 聚酰胺
          • 是通过酰胺键聚合而成的一类高分子化合物，分子中含有丰富的酰胺基
          • 吸附规律
            • 酚羟基数目多，吸附力强
            • 能形成分子内氢键者，吸附力下降
            • 母核芳香化程度高者，吸附力增强
            • 水（介质）中吸附力强，水洗脱力弱
          • 应用：主要用于中药中的黄酮、蒽醌、酚类、有机酸、鞣质等成分的分离
      • 洗脱剂和展开剂
        • 当被分离成分为弱极性物质时，常选用强极性的吸附剂，极性小的溶剂为洗脱剂，在洗脱过程中，极性小的化合物被先洗脱下来，极性大的化合物被后洗脱下来
        • 强极性物质与之相反
        • 以氢键吸附为主的吸附色谱：其常用的洗脱能力由小到大的顺序为： 水<甲醇/乙醇<丙酮<稀氢氧化胺水溶液/稀氢氧化钠水溶液<甲酰胺<二甲酰胺
    • 凝胶过滤色谱
      • 葡聚糖凝胶过滤色谱
        • 原理：分子筛作用（大→小）
        • 溶胀溶剂：水
        • 应用：多糖，多肽，蛋白质分离
      • 羟丙基葡聚糖凝胶过滤色谱
        • 原理
          • 糖苷：分子筛作用
          • 苷元：吸附原理
        • 溶胀溶剂：水，极性有机溶剂或二者的混合溶剂
        • 适用于不同类型化合物的分离
    • 离子交换色谱
      • 特点
        • 利用混合物中各成分解离度差异进行分离的方法
        • 固定相：离子交换树脂 流动相：水或与水混合的溶剂
        • 原理：流动相中存在的离子性成分与树脂进行离子交换反应而被吸附
        • 化合物解离度大（酸性或碱性强）易交换在树脂上，相对来说也难被洗脱下来
        • 离子交换色谱法主要适合离子性化合物的分离，如生物碱、有机酸、氨基酸、肽类和黄酮类成分
      • 类型
        • 阳离子交换树脂
          • 强酸型：SO₃H
          • 弱酸性：COOH
          • 根据上述原理可采用不同型号的离子交换树脂，将中药在水中具有一定溶解度的酸，碱与两性成分分开。中药中的生物碱，特别是水溶性生物碱可用阳离子交换树脂分离与纯化
        • 阴离子交换树脂
          • 强碱型：N（CH₃）₃X
          • 强碱型：N（CH₃）₂（C₂H₄OH）X
          • 弱碱型：NR₂
          • 弱碱型：NHR
          • 弱碱型：NH₂
      • 离子交换树脂的选择
        • 被分离的物质为生物碱阳离子时，选用阳离子交换树脂
        • 被分离的物质为有机酸阴离子时，选用阴离子交换树脂
        • 被分离的离子吸附型强（交换能力强），选用弱酸或弱碱型离子交换树脂
        • 被分离的离子吸附性弱，应选用强酸或强碱型离子交换树脂
      • 洗脱剂的选择
        • 阳离子交换树脂中，常用稀盐酸，醋酸，磷酸缓冲液
        • 阴离子交换树脂中，则应用氨水，吡啶等缓冲液
        • 对复杂的多组分则用梯度洗脱方法，即有规律地随时间而改变溶剂的性质，如：PH，离子强度等。如分离生物碱时，可用强酸型树脂，以氨水或氨性乙醇洗脱
    • 大孔吸附树脂
      • 特点
        • 大孔吸附树脂色谱是利用化合物与大孔树脂吸附力的不同及化合物分子量大小的不同，在大孔树脂上经溶剂洗脱而达到分离的方法
          • 色谱行为具有反相色谱的性质
        • 对洗脱剂而言，极性大的溶剂洗脱能力弱，而极性小的溶剂则洗脱能力强。故大孔树脂在水中的吸附能力强
        • 实际工作中，常先将欲分离的混合物的水溶液通过大孔树脂后，依次用水，浓度由低到高的含水甲（乙）醇溶液，甲（乙）醇洗脱，可将混合物分离成若干组分
      • 吸附原理（较复杂，大体分两种）
        • 吸附性：大孔树脂本身具有吸附性，由范德华力或氢键吸附的结果
        • 筛性原理：是由其本身的多孔性所决定的
      • 例
    • 分配色谱
      • 特点
        • 是利用被分离成分在固定相和流动相之间的分配系数的不同而达到分离
        • 流动相的极性小于固定相的极性→正相色谱，主要用于分离极性及中等极性的分子型化合物
        • 流动相的极性大于固定相的极性→反相色谱，流动相常用甲醇-水或乙腈-水，主要用于分离非极性及中等极性的各类分子型化合物
      • 载体：常用的有硅胶，硅藻土，纤维素粉等
      • 在利用键合相硅胶（ODS）进行反相色谱时，流动相常用甲醇-水，乙醇-水或乙腈-水（并不常用）
  • 分馏法
    • 分馏法是利用液体混合物中各成分的沸点不同进行分离的方法
    • 分馏法通常分为分馏、减压分馏、分子蒸馏等
    • 在中药化学成分研究中，分馏法主要用于挥发油和一些液体生物碱的分离
  • 盐析法
    • 在中药的水提取液中加入易溶于水的无机盐至一定浓度，或达到饱和状态，可使某些成分由于溶解度降低而沉淀析出，或用有机溶剂萃取出来，从而与水溶性较大的杂质分离。常用的无机盐有：NaCl、Na₂SO₄、MgSO₄、（NH₄）₂SO₄等
  • 透析法
    • 是利用天然或人工合成的高分子膜，以外加压力或化学位差为推动力，小分子成分在溶液中透过膜，而大分子成分不能透过膜的性质达到分离的方法。从而对混合物溶液中的化学成分进行分离，分集，提纯和富集
    • 反渗透，超滤，微滤，电渗析为已开发应用的四大膜分离技术
• 现代分离方法
  • 高效液相色谱法
    • 在所有高压液相色谱分离工作中，约有95%使用的是C-18反向硅胶
    • 反相色谱一般采用甲醇，乙醇，甲醇-水，乙腈-水等作为流动相
    • 反向色谱柱适用于分离高极性和（或）水溶性化合物。
    • 常用检测器的类型有紫外检测器，示差检测器，但都有其局限性，示差检测其对温度变化很敏感，对小量物质的检测不理想，且不能采用梯度洗脱。紫外检测器，则对无紫外吸收的样品束手无策，所以近年来蒸发光散射检测器（ELSD）日益受到欢迎，是质量型的检测器，不仅能检测无紫外吸收的样品，也可采用梯度洗脱，适于检测一切非挥发性成分。
  • 超滤法
    • 超滤技术是膜分离法的一种，是利用具有一定孔径的多孔滤过膜，对分子大小不同的化学成分进行筛分，而达到相互分离的方法。
    • 根据分离的目的不同，可将膜分离法分为微滤，超滤，纳滤三种主要类型。
  • 液滴逆流色谱法
    • 液滴逆流色谱法（DCCC）是一种在逆流分配法基础上改进的液-液分配技术。
    • 它要求流动相通过固定液相柱时能形成液滴，流动相形成的液滴在细的分配萃取管中与固定相有效的接触摩擦，不断形成新的表面，促进溶质在两相溶剂中的分配，使混合物中的各化学成分，在互不任意混溶的两相液滴中，因分配系数不同而达到分离。
• 中药化学成分分离方法的应用
  • 关键在于把握粗提物中化学成分的物理化学性质，根据各成分间的差异性进行分离
  • 分离方法按原理及适用范围分为
    • 通用性分离方法
      • 大多数用的
      • 在设计或选择分离方法时，最需要注意和经常利用的中药化学成分的物理化学性质主要包括化合物的极性，酸碱性和分子量的大小
      • 依据极性差异→依据酸碱性差异→依据分子大小差异
    • 专属性分离方法
      • 指针对一类化学成分特有的物理化学性质开展分离的方法，适用于将此类化学成分与其他化学成分进行分离，包括专属试剂沉淀法，聚酰胺色谱等。
• 中药是典型的复杂物质体系
  • 含有不同类型的化学成分
  • 又以极性和非极性成分并存
  • 小分子和大分子成分同在
  • 不仅有常量成分，还有微量成分

结构研究方法

• 目的：为深入探讨有效成分的生物活性、构效关系，体内代谢以及进行结构改造，人工合成等研究提供必要的依据。
• 中药有效成分的理化鉴定
  • 物理常数的测定
    • 熔点熔距0.5℃～1.0℃
    • 比旋度：光学活性成分一般要测其比旋度
    • 沸点：除高沸点物质外，沸程<5℃
    • 折光率：液体纯物质具有恒定的折光率
    • 比重：液体纯物质具有恒定的比重
    • 旋光谱、圆二色谱：确定中药有效成分的结构，官能团位置以及分子构象
  • 分子式的确定
    • 元素分析法——自动元素分析仪
      • 快速、简便
      • 检查含有哪几种元素并测定其百分含量，得出实验式
      • 利用质谱法得出化合物的分子量，最后求得分子式
    • 质谱法（MS）
      • 最常用方法
      • 高分辨质谱（HR-MS）：直接得到精确的分子量和分子式
  • 结构骨架及官能团的确定
    • 不饱和度计算
      • 意义：得出可能含有的双键数或环数
      • 计算方法：U=Ⅳ-Ⅰ/2+Ⅲ/2+1 【Ⅰ：一价原子数目（H，X）； Ⅲ：三价原子数目（N，P）； Ⅳ：四价原子数目（C，N）】
    • 化学方法
      • 碱液反应：羟基蒽醌类化合物
      • 盐酸镁粉反应：黄酮类化合物
      • L-B反应：甾体母核
      • Molish反应：糖及苷类化合物
    • 色素方法
      • 标准品对照法
  • 已知化合物鉴定
    • 有标准品（或对照品）
      • Co-TLC（共薄层）
      • 测混合熔点（相同溶剂结晶）
      • 测IR（考察是否重叠）
• 中药有效成分的波谱测定
  • UV光谱
    • 用途
      • 可提供分子中共轭体系的结构信息
      • 可据此提供判断取代基的种类，位置和数目
      • 加入诊断试剂可推测化合物的精细结构
    • 化合物的用量：痕量
    • 特点
      • 只能给出部分结构信息，不能给出整体结构信息
      • UV光谱不能确定分子结构，必须与IR，NMR以及MS以及其他理化方法结合，才能得到可靠的结论
  • IR光谱
    • 用途
      • 已知化合物鉴定
      • 未知化合物功能基的确认
        • 4000～1333cm⁻¹是特征区
        • 1333～500cm⁻¹是指纹区
      • 芳环取代类型判断
    • 化合物用量：一般只需5～10μg
    • 特点
      • 如果被测定物和已知化合物红外光谱一致，则可判定二者是同一物质
    • 红外光谱分子振动能级谱
      • 3750~3000 v强吸收O-H、N-H
      • 3300～3000 v不饱和C-H
      • 3000～2700 v饱和C-H
      • 2400～2100 v不饱和三键
      • 1900～1650 v C=O及其衍生物
      • 1680～1500 v C=C、C-N及芳香核骨架振动
      • 1500～1300 δ饱和C-H面内弯曲振动
      • 1000～650 δ不饱和C-H面外弯曲振动
  • NMR
    • ¹H-NMR
      • 为结构解析提供信息
        • 化学位移（δ）
          • 用于判断H的化学环境
          • 化学位移值与电子云密度有关，电子云密度降低，去屏蔽作用增强，向低场位移，δ增大。
          • 影响化学位移的因素
            • 诱导效应
              • 取代基电负性越强，质子化学位移向低场移动幅度越大
              • 诱导效应随链增长而减弱
            • 共轭效应
              • 吸电效应与供电效应谁占优势，谁的作用突出
              • 使质子向相应的地方移动
            • 磁各向异性效应
              • 大部分氢键形成→低场位移→δ↑
            • 氢键缔合
              • 氢键效应对化学位移的影响与氢键强弱（与溶液浓度、温度有关）有关
        • 耦合常数（J）
          • 偶合裂分是由原子核引起的，一般通过化学键传递
          • 相互耦合的H核，其J值相同
          • 一级图谱（磁等同氢之间）偶合裂分，遵循n+1规律。
          • 归属H核，判断排列情况（分子结构）
          • 偶合分类
            • 同碳耦合
            • 邻耦
            • 远程耦合
        • 积分强度，峰面积
      • 氢谱解析程序
        • 1.确认水峰和溶剂峰
        • 2.计算各峰的相对质子数（氢质子的数量）
        • 3.识别强的单峰和特征峰，识别活泼氢
          • S：单峰
          • d：双峰
          • t：三峰
          • q：四重峰
          • m：多重峰
        • 4.苯环和双键的质子信号
        • 5.解析一级谱（n+1），计算耦合常数
        • 6.解析二级谱（不遵循n+1）计算耦合常数
        • 7.组合可能的结构式
    • ¹³C-NMR
      • 为结构解析提供信息
        • 化学位移
          • 碳所处的化学环境
          • 影响化学位移的因素
            • 碳杂化方式：一般δsp²>δsp>δsp³
            • 取代基不同导致电子云密度不同（键结合方式：电子流向电负性强方向移动）
              • 一般电子云密度越小，化学位移越大，电子云密度越大，化学位移越小。
            • γ-效应
              • 较大基团对γ位碳上的氢通过空间有一种挤压作用，使电子云偏向碳原子，碳化学位移向高场移动，称为γ-效应
              • 在这种效应中γ-顺式要比γ-反式产生的效应大得多
            • 共轭效应
              • 苯环上的取代基供电：迫位向低场位移，邻、对位高场位移，间位略向低场位移。
              • 苯环上的取代基吸电：迫位向高场位移，邻、对位低场位移，间位略向高场位移。
            • 分子内部作用—氢键作用：分子内氢键使羰基的化学位移值增加
        • 峰高或峰面积
        • 碳信号的裂分
      • 常见的¹³C-NMR谱类型
        • 全氢去偶谱（COM）或噪音去偶谱（PND）或质子宽带去偶谱（BBD）
          • 特点：图谱简化，所有信号均呈单峰
        • 偏共振去偶谱（OFR）
          • 特点：由于部分偶留¹H的耦合影响，可识别伯、仲、叔、季碳
        • DEPT谱
          • 特点：不同类型¹³C信号呈单峰，分别朝上或向下
          • 可识别CH₃、CH₂、CH、C
          • 脉冲宽度
            • θ=135°，CH₃、CH↑，CH₂（常用）
            • θ=90°，CH↑
            • θ=45°，CH₃，CH₂，CH↑，季碳不出现
      • 碳谱解析程序
        • 1.确认溶剂峰，结合氢谱，确认碳的个数
        • 2.识别特征峰（例如：OCH₃～55ppm）
        • 3.识别sp²苯环和双键的碳信号（90～165ppm）
        • 4.识别sp连氧碳信号（50～110ppm）
        • 5.识别sp³碳信号（0～55ppm）
        • 6.结合氢谱，组合可能的结构式