15章DAN合成

双螺旋的解链由“解旋酶”催化。复制起始，解旋酶与一条链结合，沿其滑动解开双螺旋。大肠杆菌中，DnaB（同六聚体）起主要作用。

DNA合成

• DNA复制
  • DNA复制特点
    • 半保留复制
      • 1958年，Meselson和Stahl通过实验证明
      • ①将大肠杆菌培养在仅有氮15标记的氯化铵的培养基中，多代后，DNA的氮原子全部为氮15
      • ②将DNA转移到仅有氮14标记的氯化铵的培养基中，培养一、二、多代，分别取样，氯化铯密度梯度离心分析
      • ③结果，转移前DNA仅有氮15条带，一代后检测到新带，相当于杂交带；二代后含有氮15带和杂交带，多代后氮15条带减弱，氮14条带增强。
      • 说明DNA复制为半保留复制，保证了生物遗传的稳定性。
    • 方向是5′→3′
      • DNA在特定区域打开，形成“复制眼”，“眼角”处形成“叉”，叫复制叉。 DNA沿复制叉进行双向复制（原核）或单向复制（真核）
      • DNA合成酶沿模板链3'→5'方向移动，向新合成的链3'-OH添加脱氧核苷酸，合成的互补链一定为5'→3'
    • 半不连续性
      • 复制时，一条链为连续复制，另一条为半不连续复制
  • DNA复制体系
    • 拓扑异构酶和解旋酶
      • 拓扑异构酶分为I型和II型，细菌中🦠II型，也叫DNA旋转酶，它在DNA复制时不断在复制叉前方引入负超螺旋，消除复制叉移动时产生的扭曲张力，促使DNA解链。I型作用相反，细胞通过严格控制两者都数量来保持DNA适宜的超螺旋状态
      • 双螺旋的解链由“解旋酶”催化。复制起始，解旋酶与一条链结合，沿其滑动解开双螺旋。大肠杆菌中，DnaB（同六聚体）起主要作用，沿5′→3′方向解开螺旋。Rep解旋酶和PriA解旋酶（均为单亚基）沿着3'→5'方向解开。Rep不是必需的，但该蛋白突变体的复制叉移动速度比正常降低两倍。
    • 单链DNA结合蛋白
      • 与解开的DNA单链结合，起保护作用
      • 大肠杆菌SSB蛋白（四聚体），结合后覆盖32nt的片段；组织DNA复性为双链，阻止DNA单链自身产生部分双螺旋，还能保护其不被核酸酶水解。具有正协同效应
    • 引物酶与引发体
      • DNA复制时，第一个脱氧核糖核苷酸的掺入有要求：在DNA聚合酶的催化下，与一小段RNA短链的3′-OH形成3′,5′-磷酸二酯键。这一段RNA称为RNA引物。 大肠杆菌中有两种合成RNA的酶；，一种DnaG,依赖DNA模板合成一小段RNA，称为“引物酶”。
      • DNA两条链均可做模板，5'→3'方向需要引物多。引物合成过程复杂，除了引物酶和解旋酶，还需要一些蛋白质共同组成复合体来完成，这类复合体称为引发体。
    • DNA聚合酶
      • 是一类以DNA为模板，催化合成互补链DNA的酶。大肠杆菌含5种，其中III主要参与DNA复制，也被称为复制酶。由10个亚基组成。α、ε和θ组成核心酶。其中α亚基具有5′→3′聚合酶活性，ε亚基具有3’→5’核酸外切酶活性，θ亚基具有刺激ε亚基的作用。ε使DNA合成中错配的碱基被及时切除，保证DNA合成的忠实性。
      • DNA聚合酶I由一条多肽链组成，分为C端大片段(Klenow)和N端小片段。大片段有5’→3’聚合酶活性和3’→5’核酸外切酶活性。N端负责RNA引物的切除和引物切除后空隙的填补。
      • DNA聚合酶结构包括手掌区、手指区、拇指区。保证三个区域的保守序列聚在一起，形成酶的活性中心。 其中手掌区序列最保守，其他区各有差异。
    • DNA连接酶
      • 能够利用能量连接双链DNA中一条单链DNA上存在的切口。 大肠杆菌利用NAD+作为辅因子，真核生物利用ATP做辅因子。
  • 大肠杆菌的复制过程
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    • 起始
      • 复制起点：ori ，相关特定序列：oriC
      • ①DnaA与ATP、HU、IHF结合，随后识别oriC的9核苷酸保守序列，与之结合，；在IHF帮助下DNA弯曲，便于DnaA在oriC的13核苷酸保守序列打开双链； ②DnaA募集DnaB、C，由DnaC和ATP酶促使DnaB与单链DNA结合。 ③之后SSB蛋白，拓扑异构酶与单链DNA相连，引物酶开始加入，合成引物。
    • 延伸
      • DNA聚合酶III起主要作用，它将dNTP加到引物RNA的3’末端，催化DNA链的延长。
      • 亲代的3’→5’链为模板时，新合成的DNA链为连续复制，叫“前导链”
      • 亲代的5’→3’链为模板时，新合成的DNA链为不连续复制，叫“后随链”。其依然按照5’→3’方向进行合成，先合成引物，随机合成一段DNA链（冈崎片段），然后又合成一个引物，重复如此。引物由DNA聚合酶I切除填补，由DNA连接酶连接，形成完整子链。
      • DNA聚合酶III的β夹子与γ复合体协助DNA聚合酶III核心酶单体与后随链模板的结合。
    • 终止
      • 终止区：含10个终止序列，前一组负责逆时针方向复制叉的终止；后一组负责顺时针。
      • 与ter位点结合的蛋白质称为Tus，是解旋酶的抑制剂。Tus与ter专一性结合后，DnaB无法解开双螺旋，导致复制叉停止移动，终止复制。
  • DNA复制的准确性
    • 可能因素
      • ①核糖核苷二磷酸还原酶的调节作用：维持4种dNTP合成的均衡，利于降低掺入新合成DNA的错误概率
      • ②DNA聚合酶的构象变化：dNTP与DNA结合，DNA聚合酶为开放构象，不能催化；当dNTP与模板正确配对后，DNA聚合酶为关闭构象，可催化聚合反应。使dNTP的掺入正确性得到了检验。
      • ③DNA聚合酶I和DNA聚合酶III的3’→5’核酸外切酶活性：可切除错误掺入的dNTP
      • ④借助RNA引物：DNA复制最初易产生错误配对，借助RNA引物可避免
      • ⑤修复酶的作用：修复酶可以修复DNA复制中产生的错误以及损伤的DNA
      • ⑥参与DNA复制的20多种蛋白质之间相互协作的精确性
  • 真核生物的复制特点
    • 5种DNA聚合酶
      • δ、ε、α主要负责DNA的合成，其中ε和δ与原核生物DNA聚合酶III相似，δ负责后随链合成，ε负责前导链。α相当于原核生物的引物酶，但它可合成RNA，也有DNA聚合酶活性，所合成的引物包括DNA和RNA两部分
    • 多个复制子
      • 从复制起点到终点称为一个复制子。不同物种或者同一物种不同组织、不同发育时期的复制子数目不同，并且不同时进行。整个细胞周期真核细胞染色体DNA只复制一次。
    • 起始复合物的组装和激活属于不同细胞周期
      • 第一阶段：G1期组装前复制复合物（不能启动复制）
      • 第二阶段：S期，由DNA聚合酶α、ε和一些特殊蛋白质等的参与下，DNA复制启动
      • 保证了整个细胞周期，染色体DNA只复制一次。
    • RNaseH1和Flap内切酶-1参与真核生物DNA复制过程中引物的切除
      • 冈崎片段前端5'前端一个核糖核苷酸由RNaseH1切除，剩余部分由Flap内切酶切除。
    • 染色体DNA复制起始和终止序列
      • 起始位点有很多个，且差别大。缺乏终止序列，每个复制叉双向移动，遇到相向的便结束。
• 逆转录
  • 逆转录酶
    • 逆转录酶由病毒基因组RNA为模板合成一条互补DNA，产生杂交体；再以单链DNA为模板，合成互补链DNA
    • 功能：①具有RNA指导的DNA聚合酶活性，能以RNA为模板合成DNA
    • ②具有核酸酶H活性，可以从3'→5'或5'→3'两个方向专一催化杂交链中的RNA降解
    • ③具有DNA指导的DNA聚会酶活性
• PCR技术
  • 体系：DNA模板、一对引物、dNTP和DNA聚合酶。周期：高温变性、低温退火和适温延伸
  • ①高温解链为两条单链；②低温退火，使引物在目标序列两端分别与DNA结合；③维持在适宜DNA链延伸的温度，由DNA聚合酶催化合成新链
  • 特点：特异性高，灵敏度高，简便快捷，对样品纯度要求低。常用于将微量的DNA分子进行大量扩增，或者从混合DNA分子中分离出目标DNA
  • 实际操作中，变性温度一般为94℃，退火温度小于引物Tm值4℃。DNA酶热稳定性很重要（TaqDNA酶最常用）
• DNA修复损伤
  • 直接修复
    • 直接将受损伤的DNA碱基恢复为正常碱基。
    • 嘧啶二聚体和碱基烷基化：光活化和酶催化修复
  • 切除修复
    • 在一系列酶的作用下，将DNA受损部分切除，以另一条链为模板，合成出正确链。
    • 损伤片段，嘧啶二聚体和单个碱基错误常用。切除修复是最普遍的。
    • 过程：①核酸内切酶在损伤部位两端切除磷酸二酯键； ②解旋酶解开受损部位双链，DNA聚合酶合成正确互补链；③DNA连接酶催化切口连接
    • DNA糖基化酶：切断核苷键，除去被修饰的碱基，使原位点无嘌呤、无嘧啶（AP位点） AP内切酶专门识别切除AP位点，某些DNA糖基化酶能识别切除与被修饰的碱基。由此，脱氧核苷酸骨架被切除，空隙由DNA聚合酶I填补
  • 错配修复
    • 修复单个dNTP的错误掺入。关键在于识别新链与模板链
    • 细菌借助半甲基化DNA区分：Dam甲基化酶可催化DNA甲基化，新链在短时间内来不及甲基化，当错误时被切除。错配碱基最易被修复。使DNA复制准确率提升几百上千倍。
  • 重组修复
    • 某些单链DNA损伤，在复制前没有完成修复或者DNA双链模板链发生断裂，可通过同源DNA重组进行修复。
  • 应急反应
    • DNA链受到严重损伤时，SOS反应可诱导产生大量切除修复和重组修复的酶类和蛋白质，用于加强修复，使细胞适应逆境，避免死亡。分为免错修复与易错修复。
    • 单一碱基变化产生的突变称为点突变。：转换：碱基被同类置换；颠换：嘧啶换为碱基（或相反） 插入或缺失一个碱基，称为插入突变或者缺失突变。引起蛋白质读码框改变，也成为移码突变。
• 着色性干皮病：紫外线下DNA形成胸腺嘧啶二聚体，由于体内缺少相关核酸内切酶， 无法修复损伤，造成干皮雀斑，皮肤癌