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Divergent receptor proteins co
Divergent receptor proteins confer responsesto different karrikins in two ephemeral weeds：包含研究内容，KAR1是燃烧植物产生的典型karrkin。与植物关系密切但与火无关的拟南芥等等
编辑于2022-04-14 09:21:10- Divergent receptor p
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Divergent receptor proteins confer responses to different karrikins in two ephemeral weeds
研究内容
KAR1是燃烧植物产生的典型karrkin。与植物关系密切但与火无关的拟南芥(Arabidopsis thaliana)优先对KAR2做出反应。α/β水解酶KARRIKIN不敏感2 (KAI2)是拟南芥中公认的KARRIKIN受体。KAI2蛋白的复制和多样化可能会对环境干扰(包括火灾)产生的化学信号产生不同的反应。
研究方法
化学合成
kararrikins (KAR1和KAR2)， 制备13[C]5标记的kararrikins和GR24对映体(GR245DS和GR24ent-5DS)
植物材料和生长测量
拟南芥kai2-2 (Ler) 和 Atd14-1 (Col-0)突变体。拟南芥生长在6:1:1混合的泥炭堆肥，蛭石和珍珠岩。采用广谱白光LED面板，发射120-150 μ mol光子m−2 s−1，光周期16 h /暗周期8 h，光周期22℃/暗周期16℃，相对湿度恒定60%。
将芥末种子干燥至相对湿度15%，1个月后放入密封袋中，保存温度为- 20°C。
本研究中使用的芥末种子是在2009年11月和12月从西澳大利亚州的两个地点(珀斯的国王公园和梅林汀)采集的。
拟南芥的莲座在萌发后约3-4周拍摄，在可见开花之前，如图图例所示。一旦初生花序停止生长，便可测定株高和分枝情况。用尺子测量从初生花序基部到顶端的高度。观察每片叶的腋部，计数初生枝;一个芽如果伸长超过5毫米，就算作一个主枝。
种子发芽试验
在相同的条件下(~ 120-150 μmol光子m−2 s−2白光，16 h光/8 h暗光，22°C光/16°C暗光)，采集拟南芥种子。
收获后，将种子在硅胶下干燥4天，在-80℃保存。将种子播种在60 mm的培养皿中，培养皿中含有1%的Phytagel, 1.5 mm MgCl2固化，并添加0.1% v/v丙酮(mock)或1µM KAR1/KAR2(1:1000稀释)。培养皿在25°C恒光下孵育1周，每24小时用显微镜对萌发情况进行评分。
将芥末种子种在玻璃微纤维滤纸放置于9cm的培养皿中，并添加丙酮或karikin处理(每个培养皿3ml水溶液)。用超纯水将丙酮(模拟)或karikin储备(溶解在丙酮中)按1:100稀释制备处理。由于芥末萌发受到光照的抑制，种子在22°C的黑暗中被吸收。每天统计发芽种子数，直到发芽率保持不变。
下胚轴伸长的测定
将50粒拟南芥种子种在60 mm的培养皿中，培养皿中含有半强度MS盐(pH 5.9)和0.7% w/v琼脂。将培养皿在4°C黑暗中分层72 h，转移到生长培养箱中，在22°C白光下照射3 h，然后在22°C黑暗中再照射21 h。然后将这些板暴露在由发光二极管提供的连续红光下(λ最大波长660 nm, 5µmol光子m−2 s−1)在22°C条件下吸附4 d。将幼苗水平放置在0.7% w/v的琼脂上拍照，使用ImageJ软件测量下胚轴长度。
将芥末种子播种在玻璃微纤维滤纸(Filtech)上，置于培养皿中，并辅以丙酮或karrikin处理。将种子在24°C的黑暗中浸泡22h，然后在连续的红光(5µmol光子m−2 s−1)下胚轴中进行测定。
记录分析
在22°C的黑暗环境中，将芥末的种子吸在玻璃纤维过滤器上，然后用kararrikins处理，处理过程与上述种子萌发试验中描述的步骤相同。在指定的时间点采集标本，在纸巾上吸干，液氮中冷冻，用于芥末种子的转录本定量。
采用两种方法对芥末幼苗进行检测。
对于图1e所示的数据，在与下胚轴伸长测定相同的条件下，播种和育苗一式三份。
对于图2b所示的数据，先在黑暗中吸收种子24 h，然后将种子转移到生长室(约120-150 μmol光子m−2 s−2白光下，16 h光/8 h暗，22°C光/16°C暗)中3d。将约20株幼苗的样品转移到250 mL的锥形瓶中，其中含有50 mL无菌超纯水，并添加1µM KAR1µM或等量的丙酮(0.1% v/v)，每次处理3个重复样品。然后，在收获幼苗之前，摇瓶24小时。
转录量化
RNA提取使用光谱植物总RNA试剂盒(Sigma-Aldrich)与柱上dna酶消化步骤。使用iScript cDNA合成试剂盒(Bio-Rad)从500ng总RNA中生成cDNA，随后将反应稀释到水中的四倍。采用罗氏LightCycler 480，在384孔格式的5 ul反应中进行定量PCR。反应包含0.4µM寡核苷酸，0.5µl稀释cDNA和1× Luna Universal qPCR Master Mix (New England Biolabs)。每个生物复制都对每个反应进行两个技术复制，并使用平均Cp值，按照公式将表达正常化到CACS参考转录本。利用串联稀释的混合cDNA，在单独运行中测定了引物效率(0.9或更高)。所有寡核苷酸列于补充表3。
KAI2和D14同源基因的克隆和诱变
利用通用正向引物BtKAI2_universal_F和同源特异性反向引物RACE_R (BtKAI2a)、Contig1_R (BtKAI2b)和Contig5_R (BtKAI2c)从具有gateway兼容attB位点的tournefortii cDNA中扩增出btkai2全长编码序列(和唯一的3 ' -UTR序列)，然后克隆到pDONR207 (Life Technologies)。pDONR207克隆经Sanger测序确认后，与pKAI2pro-GFP-GW41重组，获得了二元植物表达质粒pKAI2pro-GFP-BtKAI2a、pKAI2pro-GFP-BtKAI2b和pKAI2pro-GFP-BtKAI2c。对于烟草中的短暂过表达(补充图5d)，通过gateway介导的重组将btkai2编码序列转移到pSKI106中，这将驱动位于烟草花叶病毒U1株全长cDNA克隆下游的编码序列的高度表达。在标准的T-DNA二元载体中camv35s启动子控制下。pSKI106也编码一个n端3 × c-myc标签。对于使用标准二进制载体在烟草中的瞬时表达(补充图6b)， BtKAI2编码序列被转移到pMDC43中，除了AtKAI2启动子和5 ' -UTR序列被一个双camv35s启动子取代外，pMDC43与pKAI2pro-GFP-GW相同。采用寡核苷酸BtD14_F和BtD14_R从cDNA中扩增出btd14a编码序列，并克隆到pDONR207中，转入pD14pro-GW41中。
从pDONR207克隆中扩增出btkai2的全长编码序列(3 ' - utr除外)，并通过Gibson组装将其与pE-SUMO载体进行重组，得到了pE-SUMOBtKAI2a、-BtKAI2b和-BtKAI2c异质粒。定点诱变产生了pesuma - btkai2al98;L191、pE-SUMO-BtKAI2bV98;V191和BtKAI2c突变体。为了在烟草和拟南芥中表达BtKAI2a、BtKAI2b、BtKAI2c和AtKAI2的突变版本，在与pKAI2pro-GFP-GW或pMDC43重组之前，对pDONR207克隆进行定点突变。在BtKAI2a和BtKAI2b双替换的情况下，在一个PCR产物中，两个目标残基同时突变，而质粒的其余部分在第二个PCR产物中扩增。这些双突变质粒经Gibson组装重组。对于单突变体，使用单对诱变引物扩增整个质粒，PCR产物自我连接。BtKAI2cQUINT的变异是通过连续两轮的诱变产生的。编码区域经Sanger测序确认。
植物转化
纯合子kai2-2和Atd14-1植株经浸花处理后发生转化。在添加20µg/mL潮霉素b的0.5 × MS不育培养基上筛选转基因初代苗木，进一步培养潮霉素抗性和敏感苗木比例为3:1的T2株系，鉴定T3代的纯合株系。试验从T3代开始进行。
为了在烟草中瞬时表达，将携带pSKI106或pMDC43突变体的农杆菌(GV3101)置于添加抗生素和20µM乙酰注射器酮的LB培养基(25 mL)中，直到OD600达到1.0。离心15 min, 5000 × g，用10 mM MgCl2、10 mM MES (pH 5.6)和100µM乙酰丁香酮。将光密度调至0.4，悬浮液置于22℃静置过夜(~14 h)。取3周龄本氏烟叶片，用5ml注射器从叶片背面向叶片内渗透。4 d后采集叶片，用液氮冷冻。
免疫印迹和抗体
幼苗被冷冻在液氮中，然后用磨珠机磨成细粉。每100 mg组织用150µl的裂解缓冲液(50 mM TRIS-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 10%甘油，0.1% Tween-20, 1 mM苯甲基磺酰氟，1 mM二硫苏糖醇(DTT)和1 ×完全蛋白酶抑制剂(罗氏))提取可溶性蛋白。裂解液经2万× g连续离心10min后澄清。用12%的SDS-PAGE凝胶分离约40µg蛋白，并将其印迹到PVDF膜上。印迹用1 × TBS-T (pH 7.5)和2% (w/v)牛血清白蛋白(BSA)在22°C条件下封闭1h。
一抗用1 × TBS-T + 0.2% (w/v) BSA稀释如下:1:2500 (anti-KAI2在兔40体内饲养);1:1000 (anti-GFP在兔体内培养，ThermoFisher Scientific A11122)， 1:2500 (anti- actin在小鼠体内培养，Sigma A0480)， 1:1000 (anti-c-myc在小鼠体内培养，Genscript A00704)。将一抗与印迹一起在4°C孵育一夜，或在22°C孵育1h，轻轻摇晃。抗体孵育之间，用1 × TBS-T洗涤4次(每次洗涤5分钟)。
二抗(山羊抗兔IgG-HRP偶联物，ThermoFisher 32460;或山羊抗小鼠IgG-AP偶联物ThermoFisher 31321)，用1 × TBS-T和0.2% (w/v)牛血清白蛋白(BSA)稀释1:1000 (HRP)或1:5000 (AP)，在22°C下印迹孵育1h。用Clarity Western ECL底物(Bio-Rad)检测HRP活性，用ImmunStar AP底物(BioRad)检测AP活性。采用ImageQuantRT ECL系统(GE Healthcare)采集化学发光图像(16位)。
Karrikin吸收测量
在每个karrikin处理下播种15个种子样本(5个时间点，每一份3份)。在每个样品中，约40mg的B. tournefortii种子在5ml的试管中，在3ml的超纯水中吸收24h。离心(3220 × g, 2 min)后，用吸管去除多余水分，称量吸胀前后的种子，计算剩余水分(大部分被种子吸收)的体积。在充分吸收的种子中加入新鲜的超纯水，总积为980 μL。然后加入20 μL的100 μM KAR1或KAR2，最终浓度为2 μM。种子在22°C的黑暗中被吸收。在指定的时间点(处理后0、2、4、8或24 h)，去除500 μL的自吸溶液，并与100 ng的13[C]5-KAR1或13[C]5-KAR2 (100 μL at 1 μg/mL)联合作为定量内标。样品用乙酸乙酯(500 μL)提取一次，1 μL的有机层用GC-MS在选择离子监测(SIM)模式下分析
KAR1在每个样本的数量的公式计算出并转换为摩尔。同样，每个样品中KAR2的含量也用公式计算，并换算成摩尔数。对于拟南芥种子，该过程按比例缩小，以获得较小质量的种子(20毫克)。
A(Ion150) 表示150年离子峰面积(KAR1来衡量),A(Ion151)表明离子的峰面积151 (13 [C] 5-KAR1),和100 ng的13 [C]在乙酸乙酯萃取前5-KAR1飙升。 按公式计算，其中N(0)表示第0时刻karrikins的摩尔质量，N(x)表示第x时刻karrikins的摩尔质量，m(种子)表示每个重复中测试的种子干重(mg)。
转录组组装与分析
将B. tournefortii种子在水中浸泡24h，在22°C的黑暗中孵育。离心收集种子，吸干，液氮冷冻。将单独的种子样本播种在玻璃滤纸上，如上所示吸干24 h，然后在20µmol m−2 s−1的连续红灯下，以22°C (16 h)/ 16°C (8 h)的温度循环培养96 h。采集一份幼苗样本(50毫克新鲜重量)，并将其冷冻在液氮中。使用光谱植物RNA试剂盒(Sigma-Aldrich)从种子和幼苗样本中提取总RNA，包括柱上dna酶步骤。用oligo(dT)磁珠(Illumina)纯化PolyA+ mRNA，并生成测序所需的cDNA文库
对原始读取进行过滤，去除适配器和低质量读取(>5%未知核苷酸，或>20%碱基调用的质量分数≤10)。过滤后，两个库都以>生成读取，99.9%的核苷酸获得Q20质量评分。转录组从头组装与Trinity74。对于每个库，contigs被组装成Unigenes;然后将两个文库中的Unigenes进行组合，得到45553个预测编码区序列，平均长度为1011 nt。然后利用BLASTn搜索结合得到的Unigenes与AtKAI2、AtD14、AtDLK2、AtSTH7和atcas的同源性。
系统发育分析和蛋白质序列分析
利用拟南芥编码序列进行BLAST搜索，在芸薹属植物中鉴定出KAI2和D14同源物。额外的序列从现有的系统发育分析中采样33。多重序列比对使用geneous R10 (Biomatters)中实现的MAFFT插件进行。对D14单子叶序列的5 '端进行微调，去除非对齐区域。采用PHYML (GTR + G + I替代模型，结合NNI和SPR搜索，以及100个bootstrap)进行系统进化分析。替代模型的选择参考PhyML75 中的Smart model Selection。补充表1提供了所有序列及其来源的列表。
在使用PROVEAN分析BtKAI2c时，将BtKAI2c与AtKAI2及其他芸薹属植物序列相比所特有的10个位点(Supplementary Fig 3)都手工编辑成每个位点的一致序列(consensus identity)。使用PROVEAN服务器，使用默认的−2.5分值，对每一个原生BtKAI2c氨基酸替换进行测试，这就是“还原”序列。补充表2给出了PROVEAN输出
来自The 1000 Plant Transcriptomes Project50的KAI2同源物通过TBLASTN搜索，使用a . thaliana KAI2蛋白序列作为查询' onekp数据库v5'，该数据库包含1328个个体样本。搜索配置返回最多500条目标序列与预期值< 0.01,使用单词大小为6的BLOSUM62评分矩阵。对核苷酸序列进行整理，在geneous软件中预测开放阅读框>700个核苷酸。每个序列选择一个ORF;人工筛选具有多个orf的与AtKAI2同源的orf。使用MAFFT多重对齐工具对orf进行翻译和对齐。从人工比对中去除少量未对齐或误译的序列，得到476条唯一序列的数据集。提取的以位置96和189为中心的对齐部分被用于生成weblogo。KAI2同系物的鉴定及其位置分析见补充资料1。
蛋白质同源性建模
KAI2结构的建模使用SWISSMODEL服务器，使用对齐模式77和a . thaliana KAI2结构3w06作为模板54。使用PyMOL v1.3 (Schrödinger LLC)生成蛋白质结构图和同源模型。使用PyMOL中的“空腔和凹腔(剔除)”设置和四个溶剂半径的空腔检测截止值，对空腔表面进行可视化。使用CASTp服务器v3.078计算腔体体积，探针半径为1.4 Å。值表示康诺利的溶剂排除体积。使用Chimera v1.12 目测空腔。对于BtKAI2a和BtKAI2b模型，在计算袋体体积时，CASTp都错误地将主袋口附近的曲面残数包括在内。如上所述，通过在腔口附近人工放置游离丙氨酸残留物解决了这个问题。
蛋白表达与纯化
将AtKAI2和btkai2编码序列克隆到pE-SUMO-Amp (LifeSensors)中，生成n端6 × HIS-SUMO融合蛋白。所有蛋白在BL21 Rosetta DE3 pLysS细胞(Merck-Millipore)中表达，并使用IMAC纯化，简而言之，培养物在30°C的Luria-Bertani培养基中生长，直到光密度达到0.8-1，然后冷却到16°C，用0.1 mM异丙基β-D-1硫代半乳糖吡喃糖苷诱导，再生长14-16h。颗粒细胞溶解在20mm消息灵通的pH值7.5,150mm氯化钠,10%的甘油,10mm咪唑和1 × BugBuster试剂(Merck-Millipore)。使用含TALON钴亲和树脂(Takara)的重力柱从裂解液中批量纯化蛋白质。色谱柱用10mm咪唑洗涤，用200mm咪唑洗脱。蛋白质经超滤和缓冲交换浓缩到20 mM HEPES pH 7.5、150 mM NaCl和10%甘油中去咪唑。
差示扫描荧光技术
使用LightCycler 480仪器(Roche)以384孔格式进行DSF。反应(10µL)包含20µM蛋白、20 mM HEPES pH 7.5、150 mM NaCl、1.25% (v/v)甘油、5 × SYPRO橙皮染料(ThermoFisher Scientific)和不同浓度的配体，最终得到5% (v/v)丙酮。方案参数为:激发为483 nm，发射为640 nm，斜坡速率为0.2°C/s，范围为20 ~ 80°C。
统计分析
数据采用单因素或双因素方差分析(ANOVA) (α = 0.05，采用Tukey的多重比较检验)。对于图4c和图5c，其中三个实验重复的数据被合并，使用混合效应模型分析数据，实验重复为随机效应，基因型和处理为固定效应。在进行方差分析之前，发芽数据采用arcsin转换，基因表达数据采用log转换。测试在GraphPad Prism 8.1版本中实现。
研究结论
B. tournefortii对KAR1最敏感
B.tournefortii对KAR1比KAR2更敏感，这是一种配体偏好，是来自火灾易发生态系统的许多karinkin敏感物种种子萌发的特征
首先，在10 nM、100 nM和1µM条件下，B.tournefortii的种子萌发对KAR1的响应始终高于KAR2(图1a和补充图1b-d)。
其次，在与拟南芥的同源序列接近的基础上，鉴定出了两个karikin反应转录本的同源基因DWARF14LIKE2 (BtDLK2)和SALT TOLERANCE homolo7 (BtSTH7)，它们在1µM KAR1处理后显著高于1µM KAR2处理后的表达量(图1 b)。
这些观察到的种子反应的差异不是由于karikin吸收的差异，因为tournefortii B. tournefortii种子在吸吸过程中从溶液中吸收KAR1和kar2的速度相似，拟南芥种子也是如此(补充图1e-f)。
除了促进原休眠种子的萌发，kararrikins还抑制了B.tournefortii幼苗的下胚轴伸长，与拟南芥一样;KAR1的作用强于KAR2(图1c, d)。
在一定浓度下，幼苗中BtDLK2的转录水平对KAR1的响应也比KAR2更强烈(图1e)。
BtKAI2a和BtKAI2b在拟南芥中具有功能
为了确定tournefortii中是否存在多个KAI2同源基因，我们检测了种子和幼苗的转录组。鉴定出3个可能的KAI2同源基因(BtKAI2a、BtKAI2b和BtKAI2c）（补充图2、3)。BtKAI2a与AtKAI2和其他十字花科植物在一个分支中组合，而BtKAI2b和BtKAI2c则在一个十字花科植物特有的分支中组合。
这种分类分布表明，BtKAI2a与AtKAI2最相似，其中BtKAI2b和BtKAI2c是在芸薹属植物进化过程中通过基因组三倍复制产生的类似物。三种BtKAI2转录本均在比丘野豌豆种子中表达，但在比丘野豌豆幼苗中仅能检测到BtKAI2a和BtKAI2b(图2b)。在种子和幼苗中，BtKAI2b的转录本是三种转录本中最丰富的，但1µM KAR1处理对所有转录本的影响都不一致。我们还鉴定了两个BtD14同源物，其中至少有一个在功能上与AtD14同源(补充图2,4)。
BtKAI2c在第98位携带一种破坏稳定的突变
在这10个位点中，R98和E129位点超过了−2.5的截断值，因此被预测为对蛋白质功能具有高度危害的位点，而D137仅略低于这一阈值(补充表2)。因此，基于此预测分析，天然的BtKAI2c蛋白携带至少两个，也可能是三个替代物，这些替代物有可能使该蛋白丧失功能。
R98具有潜在的高度毒性，因为它位于催化丝氨酸附近的活性位点，而E129和D137位于连接盖子和核心区域的柔性铰链上(补充图6a)。在AtKAI2中，G133E突变是高度不稳定的20,41，这表明在铰链区域的非保守替换也可能是有害的。
为了测试这些残基对BtKAI2c稳定性的影响，我们构建了3个突变体，将BtKAI2c的原序列在甘蓝属植物的98或铰链区还原为一致氨基酸:BtKAI2cR98V，四倍突变体BtKAI2cE129D;D130V;E133Q;D137E (BtKAI2cQUAD)，以及一个包含所有5个替换的五组突变体(BtKAI2cQUINT)。
如果这些在稳定转化的拟南芥中，我们发现原生GFPBtKAI2c蛋白无法检测到，BtKAI2cQUAD变体也无法检测到(补充图6b)。但BtKAI2cR98V和BtKAI2cQUINT检测明显。我们还检测了等效的V96R突变对GFP-AtKAI2的影响，发现与原生GFP-AtKAI2对照相比，该突变完全消除了GFP-AtKAI2的表达(补充图6b)。
这些结果表明R98残基导致了BtKAI2c蛋白表达的缺失，且该位置的精氨酸一般不为KAI2蛋白所耐受。
在粗裂解液中，SUMO-BtKAI2c R98V的表达量比原生SUMO-BtKAI2c高出约10倍，这表明R98V突变增强了细菌细胞中蛋白质的折叠或稳定性。
虽然在粗裂解液中可以检测到SUMO-BtKAI2c，但在亲和层析后，SUMO-BtKAI2c始终不会被回收;相比之下，R98V和五倍体突变版本在高水平和高纯度下稳定恢复(补充图6c)。从这些结果中，我们得出结论，BtKAI2c是由于活性位点高度非保守取代引起的蛋白质不稳定性而非功能性的。
BtKAI2a和BtKAI2b具有不同的配体特异性
基因种子对karrkin的萌发响应明显:BtKAI2b种子在1 μM时对KAR1的萌发响应强于对KAR2的萌发响应，而BtKAI2a种子对karr1的萌发响应无显著差异。BtKAI2c种子与kai2对照无明显区别，且对kararrikins不敏感。
没有一个转基因株系完全恢复了野生型的萌发水平，这可能反映了我们的转基因中不包含的额外的种子特异性调控元件的需要。或基因组环境对KAI2在种子中正确表达的重要性。 在拟南芥种子中，对卡氏菌有反应的KAR-UP F-BOX 1 (KUF1)转录本的水平仅被卡氏菌轻微诱导BtKAI2a转基因种子，但被BtKAI2b种子中的kar1强烈增强(图3b)。
BtKAI2b的配体特异性在很大程度上促进了该物种在这些生命周期阶段对kar1的响应。
BtKAI2a在配体特异性方面与AtKAI2相似，而BtKAI2b对KAR1的偏好明显高于KAR2。在B.tournefortii的种子和幼苗中，BtKAI2b比BtKAI2a表达更高(图2b) 下胚轴伸长(图3c)和DLK2转录本水平(图3d)对karrkin的响应与karrkin偏好方面的萌发响应大体一致，BtKAI2b转基因显示出对KAR1的明显偏好高于KAR2。而BtKAI2a幼苗对KAR2的偏好在种子中不明显。 幼苗中，BtKAI2a和BtKAI2b都能与kai2下胚轴伸长表型互补，但BtKAI2c不能(图3c)。
98位和191位决定配体的特异性
催化失活性的D14和KAI2变体不响应DSF中的GR24，这表明热响应的变化是由配体水解和受体相应的构象变化引起的。在DSF检测中，AtKAI2对>100µM gr24 - 5ds有特异性反应，但对karikins41无特异性反应。BtKAI2a和BtKAI2b也对DSF中的karikins无反应(补充图9a)。
DSF被广泛用于推断类似单脚金内酯的化合物与D14-和kai2相关蛋白的相互作用。 外消旋GR24是一种广泛应用的合成独脚金内酯类似物，由两个对映体组成(补充图1a)，其中GR24ent-5DS通过atkai具有生物活性。 我们使用gr24t - 5ds作为替代底物的DSF分析方法来分析BtKAI2a和BtKAI2b之间配体相互作用的差异。 我们使用n端6xHIS-SUMO作为溶解度标签，以帮助在大肠杆菌中的表达，增强稳定性。我们发现该标签的存在并不影响BtKAI2b对gr24t - 5ds的热失稳反应(补充图9b).
BtKAI2b比BtKAI2a对GR24ent-5DS更敏感，BtKAI2a在这方面与AtKAI2最相似。
SUMO-AtKAI2和SUMO-BtKAI2a对>100µM gr24en - 5ds的反应相似，而SUMO-BtKAI2b对>25µM的反应明显(补充图9c)。 我们使用一个较低的GR24ent-5DS浓度范围(0-50µM)来确定反应阈值，其定义为在蛋白质熔化温度(Tm)下荧光最大变化速率的统计显著降低。 虽然SUMO-BtKAI2a仅在40µM和50µM gr24en - 5ds时表现出微弱且不显著的反应，但SUMOBtKAI2b在10µM及以上时表现出显著的反应(图4a)。
被子植物96位和189位之间有相互依赖关系