导图社区 第5章 植物细胞融合技术
第5章 植物细胞融合技术的思维导图。从主要内容及其要求、植物原生质体制备、原生体培养、植物原生质体融合几个方面作了归纳梳理。
这是一篇关于第十二、十三章：B、T介导的免疫应答的思维导图，分别介绍了B淋巴细胞的免疫应答和T淋巴细胞的免疫应答相关的知识点总结，供大家学习借鉴。
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第5章 植物细胞融合技术
主要内容及其要求
掌握植物原生质体的制备、培养、融合及杂合体的鉴定技术。
细胞融合是在自发或人工诱导下，两个不同基因型的细胞或原生质体融合形成一个杂种细胞的过程。
它可从细胞水平来改变植物细胞的遗传特性，用于改良培育植物新品种，缩短植物育种过程。
植物原生质体制备
亲本选择
★生长旺盛、生命力强的组织细胞；
★选择处于对数生长早期的细胞、愈伤组织和植物器官（叶、下胚轴），叶肉组织较理想；
★酶解游离原生质体之前对植株进行预处理（暗处理、低温处理、组培的培养基上培养）
亲本选择时考虑的因素
★ 容易分离获得、活力强、遗传一致的原生质体，容易培养再生植株（至少一方容易）；
★应带有可供融合后识别的异核体的性状，如颜色、核型和染色体差异；
★ 如目的是育种，亲缘关系或系统发育关系不应过远；
★根据需要，可以选择含有部分遗传信息或部分染色体的一个亲本的亚细胞和另一个亲本的正常细胞融合。
原生质体的制备
分离方法
★ 机械法
利器或机械研磨
缺点：获得完整的原生质体少，繁琐费时。
★ 酶解法
酶种类、浓度、处理时间不同；
优点：获得大量原生质体；
缺点：酶制剂含有核酸酶、蛋白酶、过氧化物酶、酚类物质等，影响活力。
原则：用最少的酶制剂品种，最少的量分离得到完整、健康的原生质体。
常用酶：纤维素酶、半纤维素酶、R-10、蜗牛酶、胼质酶、EA3-867酶（常用）等。
原生质体纯化
★ 离心沉淀法（沉降法）
原生质体混合物经微孔过滤后，低速900-4500r/min离心2min, 沉淀再用与酶液具相同糖浓度溶液反复洗3-4次，后用培养液洗涤备用。
缺点：相互挤压损伤甚至破碎，纯度不够。
★ 飘浮法
依据：原生质体（密度小）、细胞或细胞碎片相对密度不同而达到分离的目的。
蔗糖漂浮方法
★ 界面法
利用高分子聚合物混合液产生两相水溶液的原理，离心可使原生质体处于两液相的界面之间。
优点：可以收到数量较大的纯净原生质体，同时避免收集过程中原生质体因相互挤压而破碎。
两相系统：蔗糖-甘露醇；PEG-Ficoll；甘露醇-Ficoll
★ 不连续梯度离心法
将原生质粗提液置于不连续浓度梯度的溶液中，经离心后分离不同比重的原生质体。
原生质体活力测定
纯化的原生质体需经活力测定后方可用于培养。
★ 形态特征：完整、饱满染色质、颜色鲜艳、球形；低渗的洗涤液或培养液中，正常膨大；布朗运动。
★ 活体染色法：0.1%番红或伊文斯蓝染色，有活力原生质体不被染色；常用双醋酸荧光素活体染色法（FAD）受到原生质体内酯酶的分解而产生荧光。
★ 光合活性：用氧电极测定呼吸或光合活性方法确定其活力。
★ 有丝分裂及再生植株
原生质体培养
通过一定方法除去细胞壁，得到一个裸露的植物细胞，即为原生质体。游离的原生质体像正常的植物细胞那样具有全能性，在一定条件下培养可以重新再生出完整植株。
培养基
★ D2a
适用于茄科、玄参科、豆科、藜科
★ D2b
再生细胞形成细胞器后，除去D2a培养基中的葡萄糖并及时补充蔗糖
无机盐
无机盐的大量元素含量稍低，钙离子含量较高，采用有机氮源而少用铵盐
渗透压稳定剂
葡萄糖、甘露醇、山梨醇、蔗糖、木糖醇、麦芽糖。
有机成分
维生素、氨基酸、有机酸、糖、糖醇
激素
1-2mg/L 2.4-D（分裂必须，分化抑制）或配以浓度0.2-0.5mg/L玉米素
原生质体培养包括原生质体胞壁再生、细胞分裂与细胞团形成、器官发生、植株再生等过程。
影响原生质体培养的因素
★原生质体活力
制备方法、渗透压稳定剂种类和浓度、质膜稳定剂种类和浓度、温度和保温时间；
★原生质体密度
104-105个/ml；
★细胞壁再生速度
对数生长期的培养细胞；
★原生质体的营养和环境
MS、B5、NT、KM等基本培养基。
原生质体培养再生过程
★细胞壁再生
培养数小时后开始，一至数天内形成细胞壁；
★细胞分裂和愈伤组织或胚状体形成；
★植株再生；
培养方法
液体培养
★液体浅层培养
将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层，封口后培养
优点：操作简便、损伤少、易于添加新鲜培养基和转移培养物。
缺点：分布不均匀、粘连现象普遍、难以定点跟踪观察单个原生质体的整个生命过程。
★微滴培养
将悬浮的密度为104-105个/ml原生质体的培养液用移液枪以0.1ml左右的小滴一滴一滴地接种到培养皿上，如果将培养皿翻转过来，则成为悬滴培养
固体培养—琼脂糖包埋培养
原生质体悬液体+热融的含琼脂的培养基在30℃下等量混合。
优点
提高植板率，可以跟踪观察整个生命过程，易于统计分裂频率。
缺点
操作要求严格（温度控制）。
液体—固体结合培养
★固液双层培养
在培养皿底部先铺上一层琼脂培养基，待固化后，在固体培养基表面再作浅层液体培养。
★琼脂糖珠培养
含有原生质体的液体琼脂糖培养基用吸管以约每滴50µL滴于培养皿中，待其固化后添加液体培养基，于摇床上旋转培养。
饲喂层培养
先用一定剂量的X射线处理，抑制细胞分裂，但仍保留一定代谢活力。将原生质体洗涤2-3次除 去由辐射产生的有毒物质，然后铺在琼脂培养基上，再将未经辐射的原生质体铺在饲喂细胞层上培养。
植物原生质体融合
技术体系的3个环节
原生质体融合
选择融合体
杂种植株的再生和鉴定
意义
克服杂交不亲和
克服生殖器官败育
克服柑橘多胚
融合细胞的类型
同核体
异核体
原生质体融合的方法
★自发融合
在溶解细胞壁过程中，有些原生质体能彼此融合形成同核体。
★诱导融合
用物理或化学的方法来诱导原生质体的融合。
步骤：两个或多个原生质体的质膜彼此靠近，局部区域质膜紧密粘连，彼此融合，融合完成，形成球形的异核体或同核体。
化学融合法
融合剂
PEG，二甲基亚砜，甘油，醋酸酯，油酸盐，硝酸钠，高PH高浓度Ca2+，脂质，钙离子配合物等。
成本低廉，容易制备和控制，活性稳定，使用方便，融合能力强；不需特殊设备，融合率高，过程不受物种限制；
过程繁琐，PEG本身对细胞有毒性。分子量小的PEG，融合效应差，又有毒性，分子量过大，则粘性太大，不易操作。
注意
事先要做好两种细胞的识别标记，如色素、缺陷型、抗性标记等。
细胞的密度应在105个／mL左右，两种细胞按1：1等量混合。
物理融合法
通过电场、磁、超声波或激光等物理因素诱导细胞融合的技术。
种类
电融合技术、激光融合技术、离子束融合技术、微流控细胞融合技术等。
直观、高效、针对性强 。
电融合技术
基础：细胞双向电泳和细胞膜可逆电降解。
电融合仪：交流脉冲电压电路、频率信号发生电路、直流单脉冲电压发生电路、其他控制电路（检测电路和数显电路）
注意事项
★对介质要求高，一般用高纯度的蒸馏水并选用适当的非电介质溶液，如甘露醇等配制等渗性介质。
★注意控制高频交流电压和直流脉冲电压的强度和时间，以防止细胞连接成串或发生可逆性降解。
★高pH-高钙处理方法
pH在10.5、50mmol/L CaCl2 •H2O 37℃处理原生质体（杂种产量高，但对细胞有毒）
★聚乙二醇处理方法
异核体形成频率高，可重复性强，毒性低。
植物体细胞杂种的筛选
★互补筛选
白化互补、遗传互补、抗性互补、激素互补
★机械筛选
植物体细胞杂种植株的鉴定
★形态特征鉴定
花的形态、大小和颜色；叶片的形态、气孔的大小和分布、株高和株型等；
★核型鉴定
染色体的计算及形态观察
★分子标记鉴定
同工酶谱分析；RuBp羧化酶分析和Fraction分工蛋白分析；叶绿体DNA，线粒体DNA，核DNA的分析 采用Southern杂交和分子标记图谱分析。
