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红细胞检验技术
红细胞检验技术的总述思维导图：包含针对的疾病，红细胞减少（贫血），临床常用的实验室检查，主要实验室检查路径，红细胞检验技术等等
编辑于2022-05-25 10:52:23- 医学检验技术
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红细胞检验技术的总述
针对的疾病
红细胞减少（贫血）
临床常用的实验室检查
诊断贫血的主要依据
血常规检查
红细胞形态观察
网织红细胞计数
骨髓细胞形态学及病理组织学检查
病因检查
红细胞增多
主要实验室检查路径
确定有无贫血
确定贫血的严重程度及类型
查明贫血的原因或原发病
红细胞检验技术
溶血的一般检验
铁代谢检验
叶酸、维生素B12测定
红细胞膜缺陷试验
红细胞酶缺陷的检验
免疫溶血性贫血检验
血红蛋白异常检验
阵发性睡眠性血红蛋白尿症有关检验
溶血的一般检验
概念
溶血性贫血(HA)：是由于各种原因使红细胞破坏过多、寿命缩短，超过骨髓的造血代偿能力时所发生的一类贫血。
溶血性疾病：发生溶血而骨髓造血能够代偿时, 不出现贫血，称为溶血性疾病。
溶血性贫血：骨髓造血失代偿，导致贫血，即溶血性贫血。
血管内溶血：红细胞在血流中被破坏，称为血管内溶血。
血管外溶血：红细胞在单核-巨噬细胞系统中被破坏，称为血管外溶血。
红细胞寿命测定
方法
核素标记法
实验原理
红细胞寿命测定是将标记放射性核素51Cr的红细胞注入血液循环后，逐日观察其消失率，记录成活曲线，以其在血液循环中消失1/2所需要时间(半衰期T1/2)表示红细胞寿命。
参考区间
正常人红细胞51Cr T1/2为25〜32天
临床意义
红细胞寿命缩短
溶血性贫血：T1/2约为14天
再生障碍性贫血：T1/2约为15〜29天
脾功能亢进：T1/2约为15〜29天
红细胞寿命延长
真性红细胞增多症
特例
缺铁性贫血：红细胞寿命多数正常，少数缩短
应用评价
该测定的缺点
准确度不高
原因
核素的半衰期和红细胞寿命之间没有线性关系
核素标记红细胞方面的技术问题
临床应用受限
原因
在此期间输血或过多抽血，有可能干扰治疗
试验周期长（至少15天）
需特殊技术
价格高昂
意义
不作为常规方法应用
是反映红细胞破坏最直接、最可靠的方法之一
注意事项
患者在接受检查前3周及检查期间要避免输血，以保证标记的是其自身红细胞以及标记红细胞不被非标记细胞所稀释，否则会影响测定结果。
检查前1周停服维生素C，因其可使六价51Cr还原成三价而减低标记率。
标记红细胞时所加入51Cr的浓度应＜2μg/ml红细胞，过量会影响红细胞存活期。
血浆游离血红蛋白测定
血浆游离血红蛋白总述
游离血红蛋白：通常血红蛋白存在于红细胞内，当红细胞破坏，血红蛋白释放入血，则为游离血红蛋白。
高铁血红素白蛋白的来源
一些血红蛋白可以在血液循环中被分解为血红素和珠蛋白；血红素能结合白蛋白产生高铁血红素白蛋白。
血红蛋白尿的原因
正常情况下，人血浆中仅含微量游离血红蛋白，且大部分与结合珠蛋白(Hp)结合。若没有足够的Hp结合游离血红蛋白，就由肾脏来清除游离血红蛋白，导致血红蛋白尿。
方法
免疫学检测法
直接分光光度法
色原比色定量法
其中邻-甲联苯胺法因无致癌作用较为常用
实验原理
血红蛋白中亚铁血红素具有类过氧化物酶活性，在过氧化氢(H2O2)参与下，可催化无色的邻联甲苯胺脱氢而显蓝色，吸收峰在630nm，加入强酸(pH 1.5)后呈黄色，吸收峰为435nm。根据颜色深浅，与同时测定的标准血红蛋白液对照，可求岀血浆游离血红蛋白的含量。
参考区间
0〜40mg/L
严重的血管内溶血血浆游离血红蛋白常为60〜650mg/L
临床意义
血浆游离血红蛋白含量增高
血浆游离血红蛋白增高是判断血管内溶血最直接的证据
体外循环所致溶血
所致溶血所致溶血
血液透析所致溶血
心脏瓣膜置换术后所致溶血
血浆游离血红蛋白含量一般正常
血管外溶血
红细胞膜缺陷症
应用评价
意义
本试验可有效判断红细胞的破坏程度，是检测有无溶血和判断血管内溶血的常规筛检方法。
该试验缺点
不如血清结合珠蛋白测定敏感
原因
当血管内发生少量溶血时，血浆中的游离血红蛋白可与Hp结合而被肝脏单核-巨噬细胞系统清除，只有当血浆中游离血红蛋白量超过Hp的结合能力时，血浆游离血红蛋白含量才增高
注意事项
本试验应该在溶血后立即取样，取样及分离血浆过程中要注意避免发生溶血。
原因：动物实验表明急性血管内溶血发生2小时后，血浆游离血红蛋白含量可减低一半。
血清结合珠蛋白测定
血清结合珠蛋白
概念
是一组由肝脏产生的糖蛋白，作用似血红蛋白的转运蛋白质。
其他
Hp能与游离血红蛋白结合形成稳定的复合物，其含量的变化与溶血直接相关。
Hp为急性期蛋白，类似血清铁蛋白。
新生儿一般在出生3个月后才可能 检测到Hp，20岁以前达到成人水平。
方法
醋酸纤维膜电泳法
实验原理
在待测血清中加入一定量的血红蛋白液，血清中的Hp即与血红蛋白形成血红蛋白-结合珠蛋白复合物（Hp-Hb复合物）。通过醋酸纤维素膜电泳法将结合的Hp-Hb复合物与未结合的Hp分开，测定Hp-Hb复合物含量，可得出血清中结合珠蛋白含量。
参考区间
0.5〜1.5g/L Hb
免疫比浊法（主要）
实验原理
在待测血清中加入一定量的抗血清Hp抗体，使之与待测血清中的Hp形 成抗Hp-Hb免疫复合物，用比浊仪测量其散射光吸光度或透光度的变化，并与标准进行比 较，计算出待测标本中血清Hp的含量。
参考区间
0.16〜2.0g/L
临床意义
血清Hp减低
严重肝病
先天性无珠蛋白血症
传染性“单个核细胞”增多症
此时不能根据该指标判断有无溶血
血清Hp增高
感染
创伤
恶性肿瘤
类固醇治疗
妊娠
此时Hp正常，不能排除合并溶血的可能
血清Hp消失
严重血管内溶血
电泳时，在其相应位置前面可出现一条区带，为高铁血红素白蛋白区带，此为血管内溶血所特有。
血清Hp测定还可作为肝细胞性黄疸及阻塞性黄疸的鉴别指标之一
肝细胞性黄疸血清Hp含量减少
阻塞性黄疸血清Hp正常或增高
应用评价
Hp有3种常见的遗传组型Hp2-l、Hp2-2、Hp1-1
免疫学测定法：考虑Hp遗传组型间的差异，否则可能造成测定结果的不一致。
电泳法：Hb可与任何遗传组型的Hp结合，故不需考虑Hp的组型。
意义
是反映溶血的较敏感指标
Hp持续下降常提示溶血过程持续存在，有助于区分血管外和血管内溶血
应注意发病与采血的间隔时间
原因：在溶血发生初期，血浆中Hp迅速降低，但数日后可由肝脏合成补充，此时测定Hp降低可能不明显
血浆高铁血红素白蛋白测定
方法
分光光度法
实验原理
血液中白蛋白和特异性的血红素结合蛋白（Hx）均能结合血红素。但血红素与Hx的亲和力远高于与白蛋白的亲和力。溶血时，游离血红蛋白先与Hp结合，当Hp耗尽后，血浆中游离血红蛋白可被氧化为高铁血红蛋白，再分解为珠蛋白和高铁血红素，后者与血中Hx结合成复合物运送到肝脏降解。当Hx也消耗完后，高铁血红素与白蛋白结合形成高铁血红素白蛋白，后者与硫化铵形成一个易识别的铵血色原，用光谱仪或分光光度计检测，于绿光区或558nm波长处有一最佳吸收区带。
参考区间
阴性（阴性不能排除血管内溶血）
阳性提示严重血管内溶血
临床意义
可用于判断溶血严重程度
血管内溶血时， 血浆中游离血红蛋白明显增高，可检测出高铁血红素白蛋白
应用评价
本试验是检测血管内溶血的重要指标。
出血性坏死性胰腺炎患者也可在580nm波长处观察到吸收区带，为假阳性。
检测标本应避免外源性溶血，才能保证该检测的准确性。
尿含铁血黄素试验
又称尿Rous试验或普鲁士蓝反应
实验原理
血管内溶血时，血中游离血红蛋白增多，可通过肾小球滤过从尿中排出，形成血红蛋白尿。此过程中部分或全部血红蛋白被肾小管上皮细胞吸收分解，以含铁血黄素的形式沉积于细胞内，随细胞脱落从尿中排出。含铁血黄素是不稳定的铁蛋白聚合体，其中的Fe3+离子在酸性环境下与亚铁氰化钾作用，产生蓝色的亚铁氰化铁沉淀。
参考区间
阴性
如阴性，在3〜7天后应重复此试验。
原因：血管内溶血首次发作72小时内可能测不到含铁血黄素尿，所以溶血早期本试验可阴性
临床意义
本试验阳性提示有慢性血管内溶血，尿中有铁排出。
在溶血初期，虽然有血红蛋白尿，但肾小管上皮细胞尚未脱落，或上皮细胞内尚未形成可检出的含铁血黄素颗粒，本试验可呈阴性。
临床上常见于阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）阳性可持续数周。
应用评价
该试验的优缺点
优点
简便、快速
不需任何特殊仪器和设备，便于开展
对判断溶血部位，特别是对诊断慢性血管内溶血有重要意义
缺点
标本、试剂、容器等容易被铁污染
导致存在假阳性和假阴性的可能
不能完全反映患者当前的临床状况
原因：尿中铁的排泄在溶血过程结束后仍然会延续一段时间
临床上其他溶血相关的实验室检査
骨髓代偿增生亢进
最突出的表现
外周血中网织红细胞增多
常达5%〜25%，多者可达70%以上，可导致MCV轻度增高
可以见到晚幼红细胞
骨髓象（为增生性贫血的表现）
幼红细胞增生显著，粒红比值降低
胆红素代谢异常
血清乳酸脱氢酶(LDH) 活性增高
红细胞肌酸增高
血涂片
可见到红细胞碎裂现象，以及出现球形红细胞、靶形红细胞、椭圆形红细 胞等异形红细胞
铁代谢检验
血清铁（SI）测定
概念：血清（浆）铁（SI）是指血浆中与转铁蛋白（Tf）结合的铁。
测定方法
原子吸收光谱法
分光光度法
实验原理
SI以Fe3+形式与Tf结合形成复合物，降低介质的pH及加入还原剂（如抗坏血酸、羟胺盐酸盐等），可使Fe3+还原为Fe2+，与Tf的亲和力降低而从复合物中解离出来。解离出的Fe2+与显色剂（如菲咯嗪和2, 2-联吡啶等）反应生成有色络合物，以铁标准液作对照，计算出血清铁的含量。
参考区间
男性：11.6〜31.3μmol/L
女性：9.0〜30.4μmol/L
其他：
均值：20μmol/L
1岁后的小儿时期：约12μmol/L
临床意义
SI增高
贫血
铁粒幼细胞贫血
再生障碍性贫血
巨幼细胞贫血
慢性溶血
慢性酒精中毒
肝脏疾病
反复输血
SI减低
缺铁性贫血
感染
恶性疾病
肾病综合征
生理性铁需要量增加：婴幼儿、青少年、妊娠妇女多见
慢性失血：成人铁缺乏最常见的原因
应用评价
意义
SI测定是一项直接反映体内运输铁含量的指标。
影响因素
生理
生理波动大，测得的血清铁只代表釆血当时的血浆铁浓度，而不能代表流动中的铁总量。
炎症
感染
此时单核-巨噬细胞系统的铁释放至转铁蛋白的过程受阻，血清铁降低并不代表贮存铁的减低。
标本溶血
玻璃容器
二胺四乙酸（EDTA）
血清铁蛋白（SF）的测定
方法
固相放射免疫分析法
实验原理
将血清铁蛋白（SF）（待测抗原）和125I标记的铁蛋白（标记抗原）与一定量的抗铁蛋白抗体（兔抗人铁蛋白）混合温育，使待测抗原与标记抗原共同竞争结合抗体，为了除去过量未结合的核素标记抗原，釆用第二抗体（羊抗兔IgG抗体）和聚乙二醇（PEG）分离沉淀抗原抗体结合物，并测定其放射性。血清中铁蛋白量与放射脉冲数呈负相关，同时应用不同浓度的铁蛋白标准液作竞争抑制曲线，即可测定血清铁蛋白浓度。
参考区间
成年男性：15~200μg/L
成年女性：12~150μg/L
其他：
小儿：低于成人
青春期~中年：男性高于女性
化学发光免疫分析法
技术
微粒酶免疫分析（MEIA）技术
实验原理
以抗铁蛋白抗体（anti-Fer）包被微粒子（M-Ab）,与标本中的铁蛋白结合形成M-Ab-Ag复合物，并被转移到纤维杯上。复合物中的微粒子能不可逆地结合到纤维杯表面的玻璃纤维上，并与加入的抗铁蛋白抗体-碱性磷酸酶共轭体结合。洗脱未结合的游离物质，加入发光底物4-甲基伞花基磷酸钠，底物的磷酸基被碱性磷酸酶水解掉后而发出荧光，通过MEIA光学装置检测该荧光产物，进而检测铁蛋白含量。
参考区间
成年男性
18~30岁：18.7~323.0μg/L
31~60岁：16.4~293.9μg/L
成年女性
绝经前：6.92~82.5μg/L
绝经后：14.0~233.1μg/L
临床意义
SF增高
体内贮存铁增加
原发性血色病
频繁输血
铁蛋白合成增加
感染
恶性肿瘤
组织内铁蛋白释放增加
肝脏疾病
SF减低
体内贮存铁减少
缺铁性贫血
失血
营养缺乏
应用评价
意义
是早期诊断缺铁性贫血的重要指标。
是判断体内铁贮存和铁营养状况最可靠和敏感的指标。
可作为孕妇、儿童铁营养状况调查的流行病学指标。
可作为肝脏疾病的辅助诊断指标（如肝癌、病毒性肝炎、酒精性肝病等）。
检测方法的优缺点
酶联免疫吸附测定法（ELISA）
优点：简便易行
缺点：易受温度、酸碱度等因素的影响
放射免疫分析法（RIA）
优点：敏感性和重复性比ELISA法好
缺点：存在试剂有效期短、辐射污染等问题
化学发光法
优点：灵敏度高，特异性强，克服了RIA法试剂有效期短和辐射污染问题，已应用于临床
缺点：需要全自动发光免疫分析仪及与仪器配套的试剂，检测成本较高
血清总铁结合力（TIBC）测定
概念
血清总铁结合力（TIBC）：指血清中转铁蛋白（Tf）能与铁结合的总量。
正常人血清中仅有1/3的转铁蛋白与铁结合
未饱和铁结合力（UIBC）：总铁结合力减去血清铁。
转铁蛋白饱和度（TS）：血清铁（SI）占TIBC的百分比。
方法
原子吸收光谱法
分光光度法
实验原理
在血清中加入已知过量的铁标准液，使血清中全部的Tf与铁结合达到饱和状态，再加入吸附剂（轻质碳酸镁）除去多余的铁。按照SI测定方法，测得的血清铁含量，即为总铁结合力。
参考区间
TIBC：
男性：50〜77μmol/L
女性：54〜77μmol/L
>80.58μmol/L即有诊断价值
UIBC：25.1〜51.9μmol/L
TS：20%~50%
临床意义
TIBC增高
细胞增多症
缺铁性贫血
转铁蛋白合成增加，铁摄入不足或需要增加所致
干细胞坏死
导致贮存铁蛋白从单细胞-巨噬细胞系统释放入血
口服避孕药
TIBC减低
肝病
血色病
贮存铁蛋白缺乏所致
肾病综合征
尿毒症
转铁蛋白丢失所致
遗传性转铁蛋白缺乏症
转铁蛋白合成不足所致
恶性肿瘤
慢性感染
溶血性贫血
应用评价
意义
TIBC
间接反映了循环血液中转铁蛋白的量
反映储铁变化时敏感性低于血清铁蛋白
与SF、SI及TS呈负相关
TS
可作为缺铁性红细胞生成的指标之一，但不宜用于缺铁的早期诊断
对缺铁诊断的准确性次于SF和红细胞碱性铁蛋白（EF）
血清转铁蛋白（sTf)测定
血清转铁蛋白
概念
血清转铁蛋白(sTf)是一种能结合Fe3+的糖蛋白，是体内最主要的铁转运蛋白。
其他
是少数几种急性期反应减低的急性时相反应蛋白之一。
主要由肝细胞和吞噬细胞合成，合成量和体内的铁储存成反比。
方法
免疫扩散法
酶免疫法
放射免疫法
免疫散射比浊法
实验原理
是利用抗人转铁蛋白血清与待检测的Tf结合形成抗原抗体复合物，其光吸收和散射浊度增加，与标准曲线比较，可计算出Tf的含量。
参考区间
28.6〜51.9μmol/L
临床意义
sTf增高
缺铁性贫血
妊娠
口服避孕药
反复出血
sTf降低
遗传性转铁蛋白缺乏症
肝病综合征
肝硬化
急性白血病
恶性肿瘤
肾病综合征
溶血性贫血
恶病质
某些炎症
应用评价
意义
可作为肝细胞损伤的指标
异质sTf还可作为肝癌标记物
可作为肾小球损伤的早期诊断指标
检测方法的选择：
血清sTf:
免疫电泳扩散法
免疫散射比浊法
尿液微量sTf：
酶免疫法
放射免疫法
这两种方法敏感性较高
血清转铁蛋白受体(sTfR)测定
血清转铁蛋白受体
概念
血清转铁蛋白受体(sTfR)是完整的细胞膜受体的一个可溶性片段，是由两个相同的85000Da亚单位构成的二硫键相连的二聚体。
其他
主要由幼红细胞在成熟过程中脱落而来
正常人约80%的 TfR被固定在幼红细胞膜上，sTfR是其游离形式
方法
放射免疫法
乳胶增强的免疫比浊法
酶联免疫双体夹心法
实验原理
将待测血清中sTfR与包被于固相载体 上的血清转铁蛋白受体特异性多克隆抗体结合，形成抗原抗体复合物，再加入酶标记的对转铁蛋白受体特异的多克隆抗体，使之与固相载体上的抗原抗体复合物进行特异性结合，洗去未结合的酶标记多克隆抗体，加入底物和显色剂使之与酶联复合物发生反应，其颜色深浅与sTfR的含量成正比。
参考区间
各实验室可根据试剂说明书提供的参考区间进行判断
临床意义
sTfR增高
缺铁性贫血早期
溶血性贫血
红细胞增多症
sTfR降低
再生障碍性贫血
慢性病性贫血
肾衰竭
表现为骨髓增生低下
应用评价
意义
是判断机体是否缺铁的一项敏感指标
十分可靠的反映红细胞内铁缺乏的指标
可用于观察骨髓增生状况和治疗反应
肿瘤化疗后骨髓受抑制程度和恢复情况
骨髓移植后的骨髓重建情况
可用于应用促红细胞生成素(EPO)治疗各类贫血过程中的疗效观察和剂量调整
反映机体贮存铁以及所需铁的数量
在调节细胞铁的摄取中发挥着关键的主用
SF和sTfR的比较：
与SF测定相比较，sTfR测定更简便、可靠。
sTfR检测无性别和年龄差异，也不受妊娠、炎症、感染、肝病和其他慢性疾病的影响，SF反之。
SF测定主要用于评价体内贮存铁的减少或消耗，sTfR则作为评价组织水平铁供应减少的一项指标。
叶酸、维生素B12测定
血清和红细胞叶酸测定
叶酸
叶酸是一种水溶性维生素，与维生素B12（钻胺素）在所有细胞的代谢中起着重要作用（尤其是增值细胞的代谢）
叶酸摄入后主要在十二指肠和空肠近端吸收（食物中）
叶酸参与嘌呤和嘧啶的形成，促进DNA的合成
叶酸在人体的贮存量为5〜20mg，近一半贮存在肝脏
叶酸是合成核蛋白、参与核酸代谢的必需物质
叶酸和(或)维生素B12缺乏时，核酸代谢障碍，骨髓粒、红、巨核三系造血细胞增殖速度明显减慢，细胞分裂障碍而导致胞体增大呈巨幼样变
方法
放射免疫分析法
实验原理
叶酸盐对蛋白质具有高亲和力，蛋白质可特异性地结合这些分子。向受检者血清中加入一定量的结合蛋白和放射标记的叶酸，使受检血清中的叶酸与放射标记的叶酸竞争性地与结合蛋白结合，用吸附剂去除游离的标记叶酸后，检测其放射活性。其活性与受检血清（红细胞）叶酸含量成反比，与已知标准管对照，计算出叶酸含量。
放射性竞争性蛋白结合法
参考区间
血清叶酸
成年男性：8.61〜23.8nmol/L
成年女性：7.93〜20.4nmol/L
红细胞叶酸
成人：340〜1020nmol/L
化学发光免疫分析法
实验原理
待测叶酸与叶酸结合蛋白（ FBP）-抗叶酸结合蛋白 （鼠抗人单克隆抗体）偶联物中的FBP结合，形成一种带负电荷的聚阴离子FBP复合物。将此复合物移至纤维杯中，纤维杯表面带正电荷的玻璃纤维静电捕获带负电荷的FBP复合 物，再于纤维杯中加入蝶酸-碱性磷酸酶共轭体与复合物中未被占据的FBP位点结合，洗涤后加入底物4-甲基伞花基磷酸钠，底物被碱性磷酸酶水解掉磷酸基而发出荧光，通过光学装置检测该荧光产物，进而检测叶酸的含量。
参考区间
血清叶酸：5.3〜14.4μg/L
红细胞叶酸：192.1〜577.1μg/L
临床意义
叶酸吸收障碍
慢性腹泻
乳糜泻
小肠切除
服用抗癫痫药
叶酸利用增加
溶血性贫血
骨髓增殖性疾病
甲状腺功能亢进
恶性肿瘤
叶酸减低
红细胞过度增生
有助于诊断由于叶酸缺乏引起的巨幼细胞贫血
应用评价
检测条件：空腹状态
检测方法的优缺点
酶联免疫吸附测定法（ELISA）
优点：简便易行、经济
缺点：易受温度、酸碱度等因素的影响
放射免疫分析法（RIA）
优点：方法可靠、 快速、精确，且可同时检测维生素B12
缺点：存在试剂有效期短、辐射污染等问题
化学发光法
优点：灵敏度高，特异性强，检测快速，克服了RIA法试剂有效期短和辐射污染问题
缺点：需要全自动发光免疫分析仪及与仪器配套的试剂，检测成本较高
血清叶酸与红细胞叶酸的比较
血清叶酸
水平降低可能仅提示过去几日叶酸摄入的减少
受即时叶酸摄入状况的影响
红细胞叶酸
水平可反映此前2〜3个月的叶酸状态
不受即时叶酸摄入状况的影响
因此体内组织叶酸缺乏但未发生巨幼细胞贫血时，红细胞叶酸测定对判断叶酸缺乏更有价值
在叶酸及维生素B12均缺乏时，红细胞叶酸也会降低，故不能采用红细胞叶酸测定进行叶酸与维生素B12缺乏的鉴别。
红细胞叶酸的水平约是血清叶酸的40倍以上
血清维生素B12测定
维生素B12
维生素B12在体内能促使叶酸形成四氢叶酸，后者是叶酸参加各种代谢过程的主要形式，故维生素B12缺乏可间接地影响叶酸参与DNA的合成。
维生素B12在人体内的贮存量 为4〜5mg。
维生素B12必须与胃壁细胞分泌的内因子（IF）结合后才能在回肠末端吸收。
方法
放射免疫分析法
实验原理
抗氧化剂和氰化钾在碱性环境下（pH>12）可将人血清中的维生素B12从载体蛋白中释放出来，与加入的57Co标记的维生素B12竞争结合固定在微晶纤维颗粒上的 维生素B12结合物，去除未结合的标记维生素B12，检测其放射活性，对照标准曲线，即可检测血清中维生素B12的含量。
参考区间
成人
60岁以下：148〜660pmol/L
60岁以上（含60岁）：81〜590pmol/L
化学发光免疫分析法（临床多用）
技术
微粒酶免疫检测（MEIA）技术
实验原理
待检血清中的维生素B12与内因子包被的微粒相结合，形成维生素B12-IF-微粒复合物。当复合物被转移到纤维杯上时，复合物中的微粒可结合到纤维杯表面的玻璃纤维上，并与再加入的维生素B12-碱性磷酸酶共轭体结合，形成维生素B12-IF-微粒-共轭体复合物。洗去未结合的游离物质，加入发光底物 4-甲基伞花基磷酸钠，底物被碱性磷酸酶水解掉磷酸基而发出荧光，通过MEIA光学装置检测该荧光产物，进而检测维生素B12的含量。
参考区间
187〜1059ng/L（< 157ng/L时为维生素B12缺乏）
分类（根据标记物的不同）
直接化学发光免疫分析
电化学发光免疫分析
化学发光酶免疫分析：具有灵敏度高、线性范围宽、安全性好、 分析方法简便快速、结果稳定性高等优点
临床意义
血清维生素B12增高
白血病
真性红细胞增多症
肝细胞损伤
某些恶性肿瘤
血清维生素B12降低
巨幼细胞贫血
髓鞘障碍症
脊髓侧束变性
血清维生素B12吸收试验
又称Schilling试验
方法
核素标记法
实验原理
是给受检者口服放射性核素57Co标记的维生素B12 0.5μg, 2小时后肌注未标记的维生素B12 1mg,收集24小时尿测定57Co排出量。
尿排泄低于正常者应再另外服用动物源性的内因子并重复上述试验， 以确定吸收不良能否被纠正。
参考区间
吸收正常者尿排泄的放射性活性为7%以上
临床意义
恶性贫血：＜5%
若恶性贫血患者补充内因子后维 生素B12重吸收得到恢复，表明维生素BI2缺乏是由于内因子缺乏引起的，而不是肠道因素。
巨幼细胞贫血：＜7%
应用评价
检测维生素B12吸收的“金标准”
对维生素B12缺乏的病因进行分析，而不是诊断是否存在维生素Bl2缺乏
由于该试验费用高、放射性废物处置以及动物源性组织应用于人体等问题，目前已不再进行Schilling试验
血清内因子阻断抗体（IFBA）测定
方法
放射免疫法
实验原理
用57Co标记的维生素B12与血清中的IF结合，形成57Co维生素B12-IF复合物；当存在内因子抗体时，形成的复合物量减少。检测其放射活性，与阳性对照管进行比较，可得知内因子抗体的存在。
维生素B12要与胃壁细胞分泌的内因子（IF）形成复合物后才能被吸收。内因子阻断抗体通过阻断IF与维生素B12的结合而影响维生素B12的吸收。
参考区间
阴性：比值≤1.00±0.10（健康人为阴性）
阳性：比值≥阳性对照血清比值±0.10
临床意义
阳性
巨幼细胞贫血
恶性贫血
由维生素B12缺乏引起
应用评价
意义
有助于查找维生素B12缺乏的原因
可作为恶性贫血的筛查方法之一（检出率约为50%以上）
红细胞膜缺陷检验
红细胞渗透脆性试验
是检测红细胞对不同浓度低渗溶液抵抗力的试验
方法
简易半定量法
实验原理
红细胞在低渗盐水中，水通过细胞膜内渗，使细胞膜膨胀破坏而溶血。实验室常使用开始溶血、完全溶血的盐水浓度衡量红细胞脆性，其脆性大小主要取决于红细胞表面积与体积的比值，比值越低，红细胞对低渗溶液的抵抗力越小（渗透脆性增加），反之，则抵抗力较高（渗透脆性降低）。
参考区间
开始溶血
3.8〜4.6g/L NaCl溶液
完全溶血
2.8〜3.2g/L NaCl溶液
临床意义
红细胞渗透脆性增高
遗传性球形红细胞增多症（HS）
遗传性椭圆形红细胞增多症（HE）
遗传性口型红细胞增多症
部分自身免疫性溶血性贫血
2型糖尿病
红细胞渗透脆性降低
珠蛋白生成障碍性贫血
血红蛋白C、D、E病
低色素性贫血
阻塞性黄疸
脾切除术后
肝炎
肝硬化
肝癌
某些中药（如当归）、磁场、紫外线
应用评价
意义
对溶血性贫血的病因诊断有参考价值，但需结合其他检验结果进行综合分析
此法也可用于丙酮酸激酶缺陷症（PKD）等红细胞酶缺陷性溶血的诊断
该试验优缺点
优点：简便实用
缺点：敏感性较差
红细胞膜异常改变较轻微的病例，应采用更敏感的试验
如红细胞孵育渗透脆性试验
原理：将红细胞先置于37℃孵育24小时，使红细胞葡萄糖消耗，ATP储备减少，红细胞膜对阳离子的主动转运受阻，阳离子在细胞内蓄积，细胞膨胀，脆性增加后，再进行相应的渗透脆性试验（以50%溶血率的盐水浓度表示）。
自身溶血试验及其纠正试验
是测定患者血液在37°C孵育48小时后， 自发产生溶血的程度
实验原理
自身溶血试验
红细胞在孵育期间，由于膜异常引起Na+内流明显增加，ATP消耗过多，或由于糖酵解途径酶缺陷所引起ATP生成不足等原因，导致ATP储备量减少，钠泵功能减弱，Na+和水在细胞内蓄积，红细胞膨胀、破裂溶血。
自身溶血试验的纠正试验
在孵育时，加入葡萄糖或ATP 作为纠正物，观察溶血能否被纠正，为自身溶血试验的纠正试验。
参考区间
健康人红细胞在无菌条件下孵育48小时
分光光度法
不加纠正物的溶血率一般＜4.0%
加葡萄糖的溶血率＜0.6%
加ATP纠正物的溶血率＜0.8%
临床意义
自身溶血率增加
遗传性球形红细胞增多症：能被葡萄糖或ATP纠正
戊糖旁路代谢缺陷：能被葡萄糖纠正
如：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PD）缺乏症
PK缺乏症：不能被葡萄糖纠正，能被ATP纠正
不能利用葡萄糖产生ATP
获得性溶血性贫血：加葡萄糖后效果不定，加ATP可明显纠正
如：PNH、自身免疫性溶血性贫血、 药物性溶血
应用评价
特异不好
仅对遗传性球形红细胞增多症有一定诊断价值
有助于溶血性贫血的鉴别诊断，但不能作为确诊试验
敏感性不好
不如渗透脆性孵育试验，已趋向于淘汰
酸化甘油溶血试验
方法
分光光度法
实验原理
当甘油存在于氯化钠磷酸缓冲液的低渗溶液时，可阻止低渗溶液中的水快速进入红细胞内，减慢溶血过程。但甘油与膜脂质又有亲和性，可使膜脂质减少，促进红细胞溶血。检测时， 吸光度随溶血的增加而下降。当红细胞膜蛋白或膜脂质有缺陷时，它们在pH 6.85的甘油缓冲液中较正常红细胞溶解速度快，导致红细胞悬液的吸光度下降至起始吸光度一半时所需的时间（AGLT50）明显缩短。通常测定AGLT50反映红细胞膜是否有缺陷。
参考区间
健康人AGLT50＞290秒
临床意义
缩短
自身免疫性溶血性贫血
肾衰竭
妊娠
遗传性球形红细胞增多症
明显缩短25〜150秒
应用评价
HbH红细胞溶解明显减少，与缺铁性贫血不同，可作为初筛试验。
本试验对遗传性球形红细胞增多症诊断的敏感性和特异性较高，也是进行家系调查的较理想方法。
该试验操作简单，但应准确配制所用试剂和严格控制试验温度，以保证结果的可靠性。
目前该试验临床上较少做。
高渗冷溶血试验
本试验是测定红细胞在不同浓度高渗缓冲液中，从37°C水浴立即置于0°C水浴一定时间的最大溶血率。
实验原理
在高渗状态下，温度骤然变化影响红细胞膜脂质的流动性，并可能累及膜磷脂与膜骨架蛋白结合位点，红细胞容易破裂而发生溶血。当膜蛋白缺陷致膜表面积与体积比值降低，溶血率明显增加；反之，溶血率降低。
参考区间
9mmol/L或12mmol/L蔗糖：最大溶血率66.5%~74.1%
7mmol/L蔗糖： 最大溶血率0.1%〜16.9%
分光光度法
临床意义
增加
遗传性球形红细胞增多症
降低
珠蛋白生成障碍性贫血
异常血红蛋白病
自身免疫性溶血性贫血基本正常
应用评价
本试验简便、易行，无需特殊试剂和仪器
是遗传性球形红细胞增多症的筛检试验之一
红细胞膜蛋白电泳分析
方法
SDS-PAGE法
实验原理
在4°C条件下，用低渗方法破坏红细胞，制备无细胞内容物的红细胞膜样品。将制备的红细胞膜样品进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-RAGE）, SDS与红细胞膜蛋白混合加热至100℃时，能使所有肽链之间的连接完全解离，同时肽链与SDS结合，形成SDS多肽复合物。以PAGE为载体，在电场作用下，膜蛋白能分离出各种区带。根据样品中各蛋白相对分子质量的不同，分离得到红细胞膜蛋白的电泳图谱，从而求得各膜蛋白组分百分率。
参考区间
正常人红细胞膜蛋白经SDS-PAGE电泳后依次出现下列主要区带
区带1、2（收缩蛋白）、区带2.1（锚蛋白）、区带3（阴离子通道）、区带4.1、区带4.2、区带4.5（葡萄糖运转蛋白）、区带4.9、区带5 （肌动蛋白）、区带6（3-磷酸甘油醛脱氢酶）和区带7等。
各实验室可根据自己的条件制定参考区间
临床意义
红细胞膜蛋白异常
先天性溶血性贫血
后天性溶血性贫血
收缩蛋白等含量减低或结构异常
遗传性球形红细胞增多症
膜收缩蛋白单独缺乏、锚蛋白与收缩蛋白联合缺乏、区带3蛋白缺乏、区带4.1、4.2蛋白缺乏等
遗传性椭圆形红细胞增多症
收缩蛋白或区带4.1蛋白缺陷
某些血红蛋白病
PNH
骨架蛋白明显异常
肝病
应用评价
本试验可直接反映红细胞膜蛋白的缺陷，有助于溶血性贫血病因分析，为红细胞膜缺陷性疾病诊断提供重要依据。
SDS-PAGE测定膜蛋白结果不够精确，大多局限于定性或半定量的研究
目前临床上更多釆用放射免疫法或ELISA法直接测定每个红细胞的膜蛋白含量
伊红-5-马来酰亚胺结合试验
方法
流式细胞技术
实验原理
荧光染料伊红-5-马来酰亚胺（EMA）可以与红细胞膜带3蛋白第一个细胞外环上的Lys430形成共价键结合，在519nm吸收光，540nm放射光。带3蛋白结合了 EMA后，其阴离子交换特性被部分抑制从而引起结构的改变。用EMA标记红细胞，釆用流式细胞术可测定其平均通道荧光强度（MCF）。
参考区间
每个实验室应确定自己的参考区间
临床意义
鉴别
遗传性球形红细胞增多症、遗传性椭圆形红细胞增多症
MCF值明显低于正常人(为正常人的 65%左右)及其他溶血性疾病
其他溶血性疾病
G-6-PD 缺乏症
自身免疫性溶血性贫血
血红蛋白病
应用评价
意义
EMA结合试验可作为遗传性红细胞膜缺陷性疾病的快速筛查方法
该方法的缺点
特异性不强
标本必须快速处理，存放可影响试验结果
红细胞膜蛋白基因检测
实验原理
釆用限制性片段长度多态性（RFLP）或串联重复序列分析可确定遗传性红细胞膜缺陷和某个基因的相关性，用单链构象多态性分析、聚合酶链反应（PCR）结合核苷酸测序等可以测定出膜蛋白基因的突变位点。
临床意义
遗传性球形红细胞增多症
大多属显性遗传，少部分为隐性遗传
归属于基因突变，突变的位置多在CpG二核苷酸（缺失或插入）
肝性脑病（HE）
膜蛋白基因突变主要包括膜收缩蛋白、4.1蛋白、带3蛋白等
多为单碱基置换，少数为其他突变或缺失
应用评价
该方法可用于诊断遗传性球形红细胞增多症
目前临床上此项目尚未能普及
红细胞酶缺陷的检验
红细胞酶总述
功能
维持红细胞完整性的作用
保证红细胞输送氧气和排出二氧化碳的功能
红细胞酶缺陷
导致红细胞寿命缩短、溶血以及贫血
首选检测的红细胞酶
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PD)
导致戊糖旁路代谢障碍
丙酮酸激酶(PK)
引起糖酵解途径异常
G-6-PD荧光斑点试验和活性测定
红细胞中的G-6-PD可催化葡萄糖-6-磷酸转化成6-磷酸葡萄糖酸，同时使反应体系中的NADP+还原成NADPH
实验原理
荧光斑点试验
NADPH在长波紫外光260〜365nm照射时发出绿色荧光，而NADP+无荧光。
活性测定
NADPH在340nm波长处有吸收峰，可直接测定340nm波长处吸光度来计算单位时间生成NADPH的量，间接反映G-6-PD活性。
WHO推荐Zinkham法的原理
参考区间
荧光斑点试验
健康人：明亮荧光
G-6-PD严重缺乏者：无荧光
杂合子或半合子：弱荧光
活性测定
Zinkham法：12.1IU/g Hb±2.09IU/g Hb(37°C)
Glock 与 McLean 法：8.34IU/g Hb土 1.59IU/g Hb (37°C )
ICSH推荐的方法
Chapman-Dem紫外分光光度法：2.8〜7.3IU/g Hb (25°C )
临床意义
蚕豆病
药物性溶血性贫血
服用的药物举例：伯氨喹、磺胺药、抗疟药、砜类药
感染
应用评价
荧光斑点试验
优点：特异性高、操作简单、标本用量少、检查时间短
意义：可用于筛查高发区域人群或疑诊的新生儿
活性测定
Zinkham法
优点
可直接测定NADPH的量
对G-6-PD缺乏症诊断的特异性和敏感度均较高
注意事项
在溶血高峰期及恢复期，酶活性可以接近正常，故应离心去除衰老红细胞再进行测定，并于2〜4个月后复查
在溶血发作期，接受红细胞输注也会影响酶活性测定结果
新生儿红细胞和网织红细胞内 G-6-PD活性较高，应注意鉴别
丙酮酸激酶荧光斑点试验和活性测定
实验原理
荧光斑点试验
丙酮酸激酶(PK)在ADP存在的条件下， 可催化磷酸烯醇式丙酮酸转化为丙酮酸，在乳酸脱氢酶(LDH)催化下丙酮酸转化为乳酸， 同时使反应体系中NADH氧化成NAD+，在长波紫外光下NADH有荧光，而NAD+无荧光， 故在长波紫外线照射下，检测以上过程荧光消失的时间来间接反映PK的活性。
活性测定
在上述酶的反应过程中，因NADH在340nm波长处有吸收峰，而NAD+没有，可通过测定340nm波长下吸光度，计算单位时间NADH减少量来求得PK活性。
参考区间
荧光斑点试验
健康人：荧光在25分钟内消失
中度缺乏(杂合子)时：荧 光25〜60分钟消失
严重缺乏(纯合子)时：荧光60分钟不消失
活性测定
ICSH 推荐 Blume 法
15.0U/g Hb±1.99U/g Hb
临床意义
PK活性下降
先天性PK缺乏症
继发性PK缺乏症
再生障碍性贫血
白血病
MDS
PK缺乏
荧光斑点不消失或时间延长提示PK缺乏
疾病
先天性PK缺乏症
分类
严重缺乏(纯合子)时：PK活性为正常的25%以下
中间缺乏(杂合子)时：PK活性为正常的25%〜50%
应用评价
PK活性荧光斑点试验是PK缺乏症的筛检试验，必要时需做活性定量加以确认。
PK活性测定特异性高，可定量，是诊断PK缺乏症直接和可靠的指标。
PK活性检测应注意是否处于急性溶血期。
由于急性溶血期外周血新生红细胞增多，酶活性可能不减低或减低不明显，应在2〜3个月后复查。
高铁血红蛋白还原试验（MHb-RT）
方法
比色法
实验原理
在待检血液中加入亚硝酸盐，使红细胞中的亚铁血红蛋白转变成高铁血红蛋白(MHb)。当红细胞内的G-6-PD正常时，可催化磷酸戊糖旁路代谢，生成足够的还原型辅酶Ⅱ(NADPH)，其脱下的氢通过递氢体亚甲蓝和MHb还原酶的作用，使高铁血红蛋白还原成亚铁血红蛋白， 溶液从暗褐色变为红色。当红细胞G-6-PD缺乏时，NADPH生成减少或缺乏，MHb不被还原或还原速度显著减慢。MHb呈褐色，在635nm波长处有吸收峰，通过比色法计算MHb还原率，可间接反映红细胞内G-6-PD的活性。
参考区间
健康人高铁血红蛋白还原率＞75%（脐带血＞77%）
临床意义
G-6-PD缺乏
高铁血红蛋白还原率下降
疾病
蚕豆病
药物性溶血性贫血
服用的药物举例：伯氨喹、磺胺药、抗疟药、砜类药
感染
分类
G-6-PD中间缺乏（杂合子型）
外周血高铁血红蛋白还原率为31%〜74%，脐血为41%〜76%
G-6-PD严重缺乏（半合子或纯合子型）
外周血高铁血红蛋白还原率常＜30%，脐血＜40%
应用评价
意义
该试验是 G-6-PD缺乏的筛查试验之一
试验的优缺点
优点
简便易行
具有较高的敏感度
缺点
耗时较长：4小时以上
特异性较差
假阳性原因
标本不新鲜
巨球蛋白血症
血红蛋白H（HbH）病
不稳定血红蛋白病
NADH-MHb还原酶缺乏
变性珠蛋白小体生成试验
方法
煌焦油蓝染色
实验原理
由于G-6-PD缺乏导致NADPH和还原型谷胱甘肽（GSH）生成减少，当酶缺陷的红细胞接触氧化性物质后， 血红蛋白所含巯基被氧化，生成变性血红蛋白或硫化血红蛋白，形成不溶性团块，附着于细胞膜上，亦称血红蛋白包涵体。在待检血样中加入乙酰苯肼，血红蛋白被乙酰苯肼氧化为 MHb，经解离成高铁血红素和变性珠蛋白，后者聚合形成变性珠蛋白小体，附于红细胞膜上。 用煌焦油蓝染色，油镜下观察并计算红细胞上含5个及以上珠蛋白小体的红细胞百分率。
参考区间
健康人含5个及以上珠蛋白小体的红细胞＜30%
临床意义
阳性细胞增高
G-6-PD缺乏症
阳性细胞常＞45%，随病情好转，阳性细胞减少甚至消失
不稳定血红蛋白病
阳性细胞常＞30%
还原型谷胱甘肽缺乏症
接触苯肼、硝基苯、苯胺等化学物质者
应用评价
该试验是诊断G-6-PD缺乏症的筛检试验之一
该试验特异性较差，对G-6-PD缺乏症的诊断还应进一步作确诊试验
谷胱甘肽还原酶缺陷检测
方法
分光光度法
实验原理
谷胱甘肽还原酶（GR）催化反应体系中的NADPH 转变为NADP+， NADPH在340nm波长处有吸收峰，测定340nm波长下吸光度的变化，通过计算单位时间生成的NADPH量来测定GR活性。
参考区间
7.17U/gHb±1.09U/gHb
临床意义
GR活性减低
先天性谷胱甘肽还原酶缺乏症
获得性谷胱甘肽还原酶缺乏症
应用评价
本试验为红细胞GR活性测定的定量试验，特异性高，是诊断谷胱甘肽还原酶缺乏症直接和可靠的指标。
G-6-PD基因检测
实验原理
目前己将G-6-PD的cDNA成功克隆，可进行核昔酸序列分析。利用限制性内切酶可研究G-6-PD基因片段长度多态性；利用PCR可确诊基因的酶缺陷型，找出突变位点。
临床意义
G1388A、G1376T和A95G为中国人最常见的突变型。
应用评价
该分析方法是一种确诊试验， 目前临床上此项目尚未能普及。
免疫溶血性贫血检验
抗球蛋白试验（AGT）
又称为Coombs试验，是检测不完全抗体的一种常用方法
实验原理
自身免疫性溶血性贫血（AIHA）患者体内产生抗自身红细胞的抗体（为IgG，不完全抗体），能与表面有相应抗原的红细胞结合，使红细胞致敏，但不凝集。
分类
直接抗球蛋白试验（DAGT）
检测红细胞表面有无不完全抗体
应用抗球蛋白试剂［抗 IgG、IgM、 IgA 和（或） 抗C3］与红细胞表面的IgG分子结合，出现凝集反应，即为直接抗球蛋白试验阳性。
间接抗球蛋白试验（IAGT）
检测血清中有无不完全抗体
应用Rh（D）阳性O型红细胞与受检血清混合孵育，若血清中存在不完全抗体，可使红细胞致敏，再加入抗球蛋白血清，可出现凝集反应，即为间接抗球蛋白试验阳性。
参考区间
健康人直接和间接抗球蛋白试验均为阴性。
临床意义
直接抗球蛋白试验（DAGT）阳性
自身免疫性溶血性贫血（主要）
当抗体与红细胞结合后，有过剩抗体时直接和间接试验均为阳性
温抗体型（多数）： 37℃条件下作用最强，主要为IgG型自身抗体
直接试验呈强阳性反应，间接试验多为阴性。
冷抗体型（少数）： 4°C 条件下作用最强，主要为IgM型自身抗体
故必要时应在4°C条件下进行试验，以排除假阴性。
主要以IgG型抗体为主，也存在IgG + C3型、C3型、IgG亚型（极少数）、IgA和 IgM型
临床一般使用广谱的抗球蛋白血清进行试验。
新生儿同种免疫性溶血
直接和间接试验均呈强阳性，可持续数周，输血或换血数天后可变成阴性。
由ABO血型不合引起的溶血，常为阴性或弱阳性。
冷凝集素综合征
阵发性冷性血红蛋白尿症
药物性免疫性溶血
溶血性输血反应
系统性红斑狼疮
传染性“单个核细胞”增多症
类风湿关节炎
淋巴细胞增殖性疾病
恶性肿瘤
某些慢性肝、肾疾病
应用评价
本试验主要用于AIHA的诊断和分型诊断，直接试验最为常用，也更有诊断价值，它能敏感地测定吸附在红细胞膜上的不完全抗体和补体。
间接试验主要用于Rh 或ABO妊娠免疫性新生儿溶血病母体血清中不完全抗体的检测。
脐血的直接试验阳性有助于新生儿溶血病的诊断
冷凝集素试验
实验原理
冷凝集素综合征(CAS)患者的血清中存在冷凝集素，为IgM型完全抗体，其在低温时可使自身红细胞、O型红细胞或与受检者血型相同的红细胞发生凝集。凝集反应的高峰在0〜4°C，当温度回升到37°C时凝集消失。
参考区间
健康人血清中抗红细胞抗原的IgM冷集素效价＜1:16(4°C )。
临床意义
阳性
冷凝集素综合征（主要）
效价可达1：1000以上
流行性感冒
支原体肺炎
淋巴瘤
疟疾
传染性“单个细胞”增多症
引起冷凝集素效价继发性增高
应用评价
该试验优点：方法简便、易于开展。
阳性者抗体：几乎均为IgM，但也有报告IgG或IgA增高。
病理性冷凝集素：
4°C：滴度＜1：256
30°C：效价仍高，甚至高于4°C滴度，更有病理意义。
冷热溶血试验
实验原理
阵发性冷性血红蛋白尿症(PCH)患者血清中存在一种特殊的冷反应抗体即Donath- Landsteiner 抗体(D-L抗体)。此抗体在20°C以下(常为0〜4°C )时与红细胞结合，同时吸附补体，但不发生溶血。当温度升至37°C时，补体被激活，红细胞膜破坏而发生急性血管内溶血。
参考区间
健康人是阴性
免疫法
临床意义
阳性
阵发性冷性血红蛋白尿症（主要）
效价可达1：40以上
某些病毒感染
麻疹
流行性腮腺炎
水痘
传染性“单个细胞”增多症
应用评价
假阴性：患者近期正处于溶血发作，补体已被消耗。
血红蛋白异常检验
抗碱血红蛋白（HbF）测定
也称为碱变性试验
抗碱血红蛋白(HbF)又称胎儿血红蛋白，具有比血红蛋白A (HbA)更强的抗碱作用。
实验原理
将待检的血红蛋白溶液中加入NaOH 溶液后，HbA即发生变性沉淀，HbF抗碱能力强，没有变性而存在于上清液中。离心后取上清液于540nm处测定吸光度，可计算抗碱血红蛋白的百分含量。
参考区间
正常情况
出生3个月后HbF比例迅速下降
新生儿可达55%〜85%。
2岁以上~健康成人：1.0%〜3.1%
临床意义
HbF相对性增多
珠蛋白生成障碍性贫血
重型：30%〜90%
中间型：5%〜 30%
轻型：＜5%
遗传性胎儿血红蛋白持续综合征
可高达100%
HbF绝对性增多
骨髓纤维化
白血病
浆细胞瘤
再生障碍性贫血
阵发性睡眠性血红蛋白尿症
卟啉病
HbF生理性增多
孕妇
新生儿
应用评价
该试验优点
重复性好
其他
除HbF外，Hb Bar's和部分HbH也具有抗碱能力， 需通过电泳鉴别
HbF酸洗脱法检测
实验原理
HbF具有抗碱和抗酸作用，其抗酸能力也比HbA强。将待检血涂片浸入pH 3.3酸性缓冲液中 37°C孵育一定时间，含HbF的红细胞不被酸洗脱，可被伊红染成红色，而含HbA的红细胞均被酸洗脱，不被伊红着色。油镜下计数1000个红细胞，计算出着色红细胞（含HbF）百分率。
参考区间
健康
成人血涂片中含HbF红细胞：＜2%
新生儿：55%〜85%
临床意义
珠蛋白生成障碍性贫血
含HbF的着色细胞增加
重型：大多数红细胞染成红色
轻型：少数红细胞染成红色
遗传性胎儿血红蛋白持续综合征
全部红细胞均染为红色
再生障碍性贫血
其他溶血性贫血
出现少量着色的红细胞
应用评价
意义
适用于基层医院对HbF增高疾病的筛检
该检测的优点
本试验简单易行
无需特殊试剂和仪器
红细胞包涵体试验
方法
煌焦油蓝染色法
实验原理
将氧化还原染料煌焦油蓝溶液与新鲜血液置37℃孵育一定时间后，不稳定血红蛋白易变性沉淀形成包涵体，呈蓝色球形小体，均匀分布在红细胞内。油镜下观察并计算500个红细胞中含包涵体的红细胞百分率。
参考区间
健康人含包涵体红细胞＜1%
临床意义
出现包涵体
HbH病
孵育时间：1h
此时的包涵体也叫HbH包涵体
阳性红细胞达50%以上
轻型α珠蛋白生成障碍性贫血
偶见包涵体
不稳定血红蛋白病
孵育时间：3h
G-6-PD缺乏
细胞还原酶缺乏
化学物质中毒
应用评价
意义
不稳定血红蛋白的定性试验
不稳定血红蛋白病和HbH病的筛检试验
异丙醇沉淀试验
实验原理
不稳定血红蛋白较正常血红蛋白更容易裂解。异丙醇为非极性溶剂，能降低血红蛋白分子内部氢键，使不稳定血红蛋白更快地裂解沉淀。在待检血红蛋白液中加 入异丙瞥于37°C作用一定时间，通过观察血红蛋白在异丙醇中的混浊或沉淀现象，对不稳定血红蛋白进行筛检。
参考区间
阴性
30分钟内不出现沉淀
脐血为阳性结果，新生儿出生6个月后为阴性
新生儿
脐血为阳性结果，新生儿出生1个月后逐渐转阴，6个月后为阴性
临床意义
阳性
不稳定血红蛋白
5分钟：出现混浊
20分钟：出现绒毛状沉淀
血液中含有较多HbF、HbH、HbE
应用评价
该试验缺点
特异性较差
易出现假阳性
其他
阳性结果只能说明存在不稳定血红蛋白
该试验只作为不稳定血红蛋白的过筛试验
血红蛋白电泳
醋酸纤维素膜电泳
实验原理
不同的血红蛋白其等电点不同，在一定pH的缓冲液中所带有的电荷不同。 当缓冲液的pH大于该Hb的等电点时其带负电荷，电泳时向阳极泳动；反之，Hb带正电荷向阴极泳动。经一定电压和时间的电泳，不同的血红蛋白因所带电荷不同、相对分子量不同，其泳动方向和速度不同，可分离出各自的区带。也可同时对电泳出的各区带进行扫描， 对各种血红蛋白定量分析。
参考区间
碱性电泳（pH 8.6）
常规采用pH 8.6 TEB缓冲液进行血红蛋白电泳分析
正常血红蛋白电泳区带：HbA>95%、HbF＜2%、 HbA2为1.0%〜3.1%。
该电泳缓冲液适合于检出HbA、HbA2、HbS、HbC
酸性电泳（pH 6.5）
pH 6.5酸性电泳用于分离HbH与Hb Bart's，HbH等电点为5.6，在pH 6.5磷酸盐缓冲液中电泳时移向阳极，Hb Bart's则在点样点不动，而其余的血红蛋白都向阴极泳动。
临床意义
HbA2增高
β珠蛋白生成障碍性贫血
是该病杂合子型的重要实验室诊断指标
血红蛋白E病（HbE病）
HbE区带与HbA2区带位置重叠，HbA2区带处增宽，含量增高幅度在10%以上
肝病
肿瘤
恶性贫血
不稳定血红蛋白病
巨幼细胞贫血
应用评价
醋酸纤维素膜电泳法
优点
简单易行、便于推广
意义
是诊断血红蛋白病的实验室检査基本方法
是分离和研究异常血红蛋白的有效方法
琼脂糖凝胶电泳法（较醋酸纤维素膜法）
优点
更为敏感
缺点
价格更为昂贵
方法也较后者复杂
等电聚焦法
实验原理
在常规凝胶电泳中，分离通常是在恒定的缓冲体系中进行的。而在等电聚焦中，血红蛋白的分离是在连续的、稳定的和线性的pH梯度中进行的。不同的血红蛋白pI值不同，只能在其等电点位置被聚焦成一条窄而稳定的带。
临床意义
可分离出一些在常规电泳中无法分离的血红蛋白
如可将部分HbD和 HbG 变异体与 HbS 分离
应用评价
该法优缺点
优点
分辨率高，对少量样本或干燥血液洗出液进行检测，可得到清晰的条带。
缺点
价格昂贵，不适用于HbA2的定量测定。
尿素裂解试验
实验原理
尿素可将血红蛋白分子的珠蛋白解离为多个肽链，通过醋酸纤维素膜电泳将多个肽链分离成肽链区带，根据肽链区带可对异常血红蛋白进行分析。
参考区间
健康成人HbA裂解为两条肽链，在pH 8.5醋酸纤维素膜电泳时，向正极快速泳动的为β链，向负极泳动的为α链。
临床意义
如在β链、α链区带以外出现异常区带，提示有异常血红蛋白存在。
应用评价
本试验是检测异常血红蛋白的筛选试验，不能确定异常血红蛋白的种类。
聚丙烯酰氨凝胶电泳
实验原理
血红蛋白液中加入尿素或对氯汞苯甲酸后，Hb分子的空间结构被破坏，裂解为多条肽链亚单位，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳可将各条肽链分离成不同区带。与正常血红蛋白电泳结果进行比较，可检测出各种血红蛋白的比例和珠蛋白氨基酸结构的异常。
参考区间
正常血红蛋白裂解后出现α、β、γ和δ四条肽链
如出现正常肽链区带之外的其他区带或正常肽链区带的改变，提示有异常血红蛋白存在
临床意义
对珠蛋白生成障碍性贫血和异常血红蛋白病的诊断和鉴别诊断有参考价值
应用评价
该方法的优点
简便易行
可作定性和相对定量分析
分辨率高
可检出醋酸纤维素膜电泳中与HbA不易区分的不稳定血红蛋白、潜在的异常血红蛋白、绝大多数α珠蛋白生成障碍性贫血
明确区分βo和β+珠蛋白生成障碍性贫血
无需特别的仪器和试剂
毛细管电泳
实验原理
毛细管电泳是一类以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，以 样品中各组分的淌度（单位电场强度下的迁移速度）和分配行为的差异为根据的液相微分离 分析技术，包含电泳、色谱及其交叉内容。
临床意义
毛细管电泳技术可分离HbA2、 HbS、HbF和HbA
可将各类正常血红蛋白和一些常见的异常血红蛋白成功地分离
异常血红蛋白：HbS、D-Punjab>、C-Arab、E-Arab、O-Arab和G-Philadelphia
应用评价
分类
按分离模式
毛细管区带电泳
应用最广
毛细管凝胶电泳
毛细管等速电泳
毛细管等电聚焦
胶束电动毛细管色谱
毛细管电色谱等类型
按操作方式
手动型毛细管电泳
半自动型毛细管电泳
全自动型毛细管电泳
该方法优缺点
优点
快速、高效、灵敏、自动化
适合于微量标本的检测
缺点
不能将HbE和HbA2、 HbF和HbA完全分离
在某些HbF增高的珠蛋白生成障碍性贫血突变类型筛查时有一定缺陷
高效液相色谱法（HPLC）
实验原理
是基于离子交换层析原理的分离分析法。以离子交换树脂作为固定相，根据各Hb的理化性质不同，利用携带负电荷的层析柱和珠蛋白成分的电荷差异，进行分离。正电荷越强的Hb，洗脱时间越长。根据Hb色谱图的出峰时间与面积可确定Hb亚型及其水平，进而初步判断珠蛋白生成障碍性贫血的类型。
参考区间
正常血红蛋白的出峰时间依次为HbF、HbA、HbA2
若存在Hb Bart's或HbH，则其岀峰时间早于HbF； HbD、HbS或HbC 则晚于HbA2。
HbE、Hb Lepore等出峰时间可与HbA2融合
临床意义
可用于珠蛋白生成障碍性贫血的筛査
典型的异常Hb，如HbD、HbS或 HbC均可在各自区域被检测出来
应用评价
意义
是为Hb分析参比方法
是HbA2与HbF定量的标准方法
HPLC优缺点
优点
检测速度快、稳定性强、精确度好
不受脂浊、黄疸标本的干扰
对β珠蛋白生成障碍性贫血筛查有很高的临床价值
可对其他Hb亚型准确定量， 能分离出HbS等异常Hb带，还能分离出常规Hb电泳无法区分的条带
缺点
与上述所有方法相比，HPLC法检测价格最昂贵
对α珠蛋白生成障碍性贫血筛查则有一定的局限性
利用该法也不能将HbE和HbA2二者分开
PCR技术检测血红蛋白基因
实验原理
应用基因探针、DNA微阵列、限制性内切酶图谱分析、聚合酶链反应技术、扩增不应突变系统技术、多重突变引物延伸扩增技术、反向斑点杂交、特异性寡核苷酸杂交等一系列分子生物学技术，均可检测出异常血红蛋白基因的存在，并可明确基因型及基因的缺陷部位等。
临床意义
对重型珠蛋白生成障碍性贫血或胎儿水肿的产前诊断具有重要的临床价值。
应用评价
该方法的优点
特异性强、敏感性高
其他
p珠蛋白生成障碍性贫血我国常见的突变位点是CD41-42、IVS-U-654、-28、CD71-72 等
釆用跨越断裂点PCR(gap-PCR)法对缺失型α珠蛋白生成障碍性贫血进行筛查
釆用反向点杂交对非缺失型α珠蛋白生成障碍性贫血的Hb基因进行检测
阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）有关检验
阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)的实验诊断， 首先要做一些常规项目的检查，结果显示为血管内溶血，然后再进行以下病因学检查。
酸化血清溶血试验
也称Ham试验
实验原理
PNH患者的红细胞由于膜有缺陷，对补体溶血效应的敏感性增加，这类红细胞在酸化(pH 6.4〜6.5)血清中孵育，可被激活的补体破坏，产生溶血。而正常红细胞不被破坏，无溶血现象。若血清经56°C加热30分钟，使补体灭活，患者红细胞即不被溶解。
参考区间
健康人为阴性
临床意义
阳性
PNH（主要）
多次输血的PNH患者，因血中所含补体敏感红细胞的数量相对减少，试验可呈弱阳 性或阴性反应，此时可延长保温时间(4〜6小时)，再观察有无溶血现象。
某些自身免疫性溶血性贫血患者发作严重时
此时，如果将血清加热破坏补体后，试验结果由阳性转变为阴性，则更支持PNH的诊断
遗传性球形红细胞增多症
球形红细胞在酸化血清内可呈假阳性反应
遗传性球形红细胞增多症在加热灭活补体后的血清中再做试验，仍呈阳性反应
应用评价
该试验优缺点
优点
操作简便
特异性强
绝大多数PNH呈阳性反应，假阳性少见，是 PNH的确诊试验
缺点
敏感性较差
Ham试验的灵敏度为50%左右
30%以上患者可呈阴性反应，因此本试验阴性时不能排除PNH
PNH分型
根据膜有缺陷的红细胞对补体的敏感性不同
Ⅰ型（补体敏感型）：强阳性
Ⅱ型（补体不甚敏感型）：弱阳性
Ⅲ型（补体不敏感型）：阴性
蛇毒因子溶血试验
实验原理
从蛇毒中提取的一种蛇毒因子可与备解素系统中的B因子结合，形成旁路途径的C3转化酶，激活血清中的补体C3，促使PNH患者补体敏感红细胞破坏、溶血。
参考区间
溶血率＜5%，溶血率＞10%为阳性
临床意义
与Ham试验基本相同
一定程度上反映PNHⅢ型红细胞的溶血状况
应用评价
本试验为PNH的特异性试验（特异性比Ham试验高 ）
PNH红细胞对本试验的敏感性：PNHⅢ型红细胞＞PNHⅡ型红细胞＞PNHⅠ型红细胞（不敏感）
本试验的溶血度高低可大致说明 PNHⅢ型红细胞所占的比例。
蔗糖溶血试验
实验原理
PNH患者的红细胞由于膜有缺陷，对补体溶血效应的敏感性增高。蔗糖溶液离子强度低，在含同型正常血清（含补体）条件下，经孵育后，可促进补体与红细胞膜结合，使对补体敏感的红细胞膜受补体攻击损伤形成小孔，蔗糖溶液进入红细胞内，导致渗透性溶血。
参考区间
定性试验：健康人无溶血
定量试验：溶血率＜5%
临床意义
阳性
PNH（主要）
AA-PNH综合征
弱阳性（或溶血率在1%〜5%）
巨幼细胞贫血
再生障碍性贫血
自身免疫性溶血性贫血
遗传性球形红细胞增多症
应用评价
该试验优缺点
优点：敏感性高
可作为PNH的筛选试验，阴性可排除PNH
缺点：特异性不强
部分自身免疫性溶血性贫血患者可为阳性
白血病、骨髓硬化时可出现假阳性
故阳性者应再做Ham试验加以证实
CD55和CD59检测
方法
流式细胞技术
实验原理
PNH是一种获得性造血干细胞基因突变引起血细胞膜缺陷所致的溶血病。其血细胞膜表面的糖化磷脂酰丝氨酸锚蛋白，如CD55（C3转化酶衰变加速因子）和CD59（反应性溶血膜抑制物）等的缺失，在骨髓及外周血产生了病态造血，致使血细胞对补体异常敏感，出现以血管内溶血为特征的一系列症状。用CD55 或CD59荧光标记的单克隆抗体，经流式细胞仪检测表达CD55和CD59的红细胞和（或）粒细胞的细胞数，计算其百分率。
参考区间
以CD59（或CD55）阴性的红细胞＞5%和CD59（或CD55）阴性的中性粒细胞＞ 10%作为PNH诊断的临界值
非PNH患者和健康人
均＜5%
PNH患者
CD59（或 CD55）阴性的红细胞均＞9%，多数患者>20%
CD59（或CD55）阴性的中性粒细胞均＞16%
临床意义
PNH
CD55、CD59低表达的异常细胞群增多
先天性 CD55缺乏者
先天性CD59缺乏者类同
先天性 CD55缺乏者极少见
缺乏者所有红细胞膜上完全无CD55，但不缺CD59
此不同于PNH部分红细胞缺失CD55、CD59
应用评价
该试验优缺点
优点
诊断PNH的特异性和敏感性较高，可达100%
缺点
试验所需仪器价格昂贵，试验成本较高
PIN
PNH分型
根据CD59
①TYPEⅠ型：CD59完全阳性正常细胞
②TYPEⅡ型：CD59部分阳性补体中度敏感细胞
③TYPEⅢ型：CD59完全阴性补体敏感细胞
PIN试验
筛查试验
蔗糖溶血试验
Rous试验
确诊试验
Ham试验
CD55、CD59的检测
CD55、CD59
缺失的意义
CD55和CD59 同时部分或完全缺失：PNH的典型表现
CD55缺失：一般不造成溶血
CD59缺失：会增加补体的敏感性。
检测血细胞CD59的敏感性比CD55的高
骨髓增生低下时检测粒细胞群的表型（CD55、CD59）更敏感、可靠
原因：补体敏感红细胞数量减少，可出现假阴性
血细胞Flaer测定分析
方法
流式细胞技术
实验原理
嗜水气单胞菌毒素能特异地与细胞膜上GPI锚连蛋白结合，随后立即聚合成多聚体，插入细胞膜脂质双层，在膜上形成孔洞致细胞溶破。PNH细胞缺乏GPI锚连蛋白而抵抗毒素，保持细胞完好。利用这一特性，釆用荧光素（如Alexa-488）标记aerolysin变异体（Flaer）,通过流式细胞术可以区分GPI阳性或阴性细胞。
参考区间
健康人和非PNH贫血患者：Flaer呈100%阳性。
在GPI锚蛋白缺失的单核细胞和粒细胞上：Flaer检测为阴性
临床意义
CD55和CD59检测结合Flaer检查，可确诊PNH
应用评价
Flaer检查
优点
Flaer的灵敏度很高
Flaer可以与其他单克隆试剂共同使用， 检测PNH克隆细胞的GPI相关锚蛋白和非GPI相关锚蛋白
与CD55、CD59比较
Flaer对PNH患者中性粒细胞的测定更为清晰、准确
其他
对PNH患者来说，白细胞尤其是中性粒细胞GPI锚连蛋白的表达对疾病的诊断更有意义
粒细胞分析时，不能简单使用FSC/SSC或CD45/SSC,易造成假阴性，因此粒细胞检测需用系列特异性抗体设门