细菌检验基本技术

1.涂片检测:一般可以用血标本、痰、尿液、粪便、脑脊液、胸水、腹水以及局部皮肤分泌物或脓肿的脓液进行涂片染色,然后在显微镜下观察细菌的形态,有些细菌形态较特殊,可以通过涂片的方法进行早期诊断,对临床指导抗菌药物有一定的帮助; 2.细菌培养:细菌培养是诊断细菌感染最可靠的检测手段,一般把细菌放在体外适宜的生长环境中,让其快速生长,通过检测感染源头进行治疗。

细菌检验基本技术

• 形态学检查
  • 显微镜
    • 普通光学显微镜
      • 细菌一般形态
    • 暗视野显微镜
    • 荧光显微镜
    • 相差显微镜
    • 电子显微镜
      • 细菌内部结构
  • 不染色标本的检查
    • 观察细菌的动力及运动情况
    • 常用压滴法\悬滴法
    • 常用普通光学显微镜，暗视野显微镜效果更好
    • 霍乱弧菌\螺旋体
  • 染色标本的检查
    • 常用染料
      • 碱性染料
        • 碱性亚甲蓝、结晶紫、碱性复红
      • 酸性染料
        • 伊红、酸性复红、刚果红
      • 中性染料
        • 瑞氏染液中的伊红甲蓝
        • 吉姆萨染液中的伊红天青
    • 常用的细菌染色法
      • 革兰染色法
        • 革兰染色
          • 原理
            • 一般认为革兰氏染色是基于细菌细胞壁特殊化学组分进行染色的。
            • 通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细菌细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，再用95%乙醇脱色。
          • 步骤
            • 制片：取菌种培养物常规涂片、干燥、固定。
            • 初染：滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为宜）染色1-2min，水洗。
            • 媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。
            • 脱色：用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。
            • 复染：滴加富红，约30s，水洗。
            • 镜检：干燥后，用油镜观察。
              • 结果
                • 紫色—革兰氏阳性菌（G+菌）
                • 红色—革兰氏阴性菌（G–菌）
          • 意义
            • 观察细菌的形态染色特点。
            • 为后续选择合适的鉴定程序提供参考依据。
            • 为临床选择用药提供参考。
          • 影响因素
            • 操作因素：涂片过厚或过薄，菌体分布不均匀，可影响染色结果。染色时脱色时间延长，细菌呈假阴性，若脱色不够，则细菌呈假阳性；若沙黄复染时间过长(数分钟)，背景和细菌都被染成革兰阴性。
            • 染液因素：所有染液应防止水分蒸发，特别是卢戈碘液存放过久或光照后容易失去媒染作用。 脱色用的乙醇若瓶密封不严或涂片上积水过多，使乙醇浓度降低而脱色能力增强。
            • 细菌因素：处在不同生长期的细菌染色结果有差异，细菌染色一般用18h～24h的细菌培养物。经用抗生素的死亡或衰退细菌，其革兰染色特性常不典型。另外，假单胞菌属由于是低吸收染料，常染成中度颜色，厌氧杆菌和其他薄壁的革兰阴性菌如布鲁杆菌、军团菌和螺菌则着色微弱。
      • 复染色法
        • 概念：细胞着色后不被盐酸乙醇脱色的染色方法
        • 原理：抗酸菌与非抗酸菌细胞壁成分不同
        • 针对结核病、麻风病等疾病的细菌检查
        • 步骤
          • 初染-固定涂片+5%石炭酸复红（加温5min）
          • 脱色：3%盐酸酒精
          • 复染：美兰（1min后镜检）
        • 结果
          • 抗酸菌：红色
          • 非抗酸菌：蓝色
      • 荧光染色
        • 敏感性强，效率高，结果易于观察
        • 主要用于结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、白喉棒状杆菌、痢疾志贺菌等检测
      • 负染色
        • 标本背景着色，细菌不着色
        • 常用染料：墨汁，酸性染料刚果红、水溶性苯胺黑
      • 特殊染色
        • 细胞壁、鞭毛、荚膜、芽孢、易染颗粒染色
• 细菌的培养与分离技术
  • 概念
    • 细菌培养： 用人工方法提供细菌生长繁殖所需的营养和最适生长条件，使细菌迅速生长繁殖。
    • 细菌分离技术：将临床标本或其他培养物中存在着多种细菌通过一定形式分开，形成有一个细菌繁殖而来的肉眼可见的细菌集落即菌落，供鉴定研究
  • 培养基
    • 主要成分及其作用
      • 营养物质
        • 蛋白胨
        • 肉浸液
        • 牛肉膏
        • 糖（醇）类
        • 血液
        • 鸡蛋与动物血清
        • 生长因子
        • 无机盐
      • 水
      • 凝固位置
        • 琼脂
        • 明胶
      • 抑制剂
      • 指示剂
    • 分类
      • 按用途
        • 基础培养基
          • 肉浸液、普通琼脂平板
        • 营养培养基
          • 血平板、巧克力琼脂平板
        • 选择培养基
          • ss琼脂平板
        • 鉴别培养基
          • 糖发酵管、ss琼脂培养、伊红亚甲蓝琼脂平板
        • 特殊培养基
          • 厌氧培养基、细菌L型培养基
      • 按理化性质
        • 液体
          • 肉汤
          • 增菌培养，接种纯种细菌，观察细菌生长现象
        • 半固体
          • 多用于观察细菌动力、保存菌种
        • 固体
          • 多用于微生物分离纯化、鉴定及药敏试验
          • 制成斜面或高层用于鉴定及菌种的短期保存
    • 制备
      • 调配
      • 溶解
      • 校正ph
      • 分装
      • 灭菌
        • 高压蒸汽灭菌法
        • 间歇蒸汽灭菌法
        • 过滤除菌法
        • 血清凝固器灭菌法
      • 质量检验
      • 保存
  • 细菌的人工培养
    • 无菌技术
    • 细菌的接种与分离方法
      • 平板划线法
      • 琼脂斜面接种法
      • 液体接种法
      • 穿刺接种法
      • 涂布接种法
      • 倾注平板法
    • 细菌的培养方法
      • 需氧培养法
      • CO2培养法
      • 微需氧培养法
        • 5%O2 10%CO2 85%N2
      • 厌氧培养法
  • 细菌的生长现象
    • 固体
      • 光滑型S、粗糙型R、黏液型M
    • 液体
      • 混浊生长、沉淀生长、表面生长
    • 半固体
      • 穿刺线两侧见羽毛状或云雾状浑浊生长为动力试验阳性
  • 培养基的选择
    • 血琼脂平板
      • 适用于各类细菌生长
    • 巧克力琼脂平板
      • 适用含有奈瑟菌属、嗜血杆菌属细菌标本
    • 肠道选择培养基
      • 中国蓝琼脂平板、ESB琼脂平板、MAC琼脂平板、SS琼脂平板
    • 血液增菌培养基
      • 用于对血液、骨髓及无菌液体标本增菌培养
    • 碱性琼脂或TCBS琼脂
      • 用于从粪便中分离霍乱弧菌及其他弧菌
• 细菌的生化鉴定技术
  • 碳水化合物代谢试验
    • 糖（醇、苷）类发酵试验
      • 原理：
  • 细菌生化鉴定技术
    • 碳水化合物的代谢试验
      • 糖(醇、苷）类发酵试验
        • 适用于肠杆菌科的细菌学鉴定
        • 结果
          • 分解糖类产酸，酸性（淡黄色)
          • 不分解糖类，无变化
          • 产气，出现气泡
      • 葡萄糖氧化/发酵试验（O/F试验）
        • 肠杆菌（发酵型）和非发酵型菌的鉴别 葡萄球菌与微球菌的鉴别
        • 结果
          • 发酵型细菌（F）
            • 有氧无氧环境中都能分解葡萄糖
              • 都变黄（产酸）
          • 氧化型细菌（O）
            • 仅在有氧环境中分解葡萄糖
              • 加液化石蜡管不产酸（不变色），不加产酸变黄
          • 产碱型细菌（-）
            • 有氧无氧都不分解葡萄糖
              • 均不变色
      • 甲基红试验（MR试验)
        • 红色——阳性，PH4.4以下
        • 黄色——阴性，PH5.4以上
        • 肠杆菌科细菌的鉴别
          • 大肠埃希菌 + 红色
          • 产气肠杆菌 - 黄色
      • VP试验
        • 红色——阳性
        • 肠杆菌科细菌的鉴别
        • 甲基红试验阳性的细菌，一般VP试验为阴性
      • β-半乳糖苷酶试验（ONPG试验）
        • 菌悬液，黄色——阳性
        • 迟缓发酵乳糖的细菌的快速鉴定
      • 七叶苷水解试验
        • 黑色——阳性
        • 不变色——阴性
        • D群链球菌（阳性）与其他链球菌（阴性）的鉴别
        • 肠杆菌科细菌、其他革兰氏阴性菌及厌氧菌的鉴别
    • 蛋白质和氨基酸的代谢试验
      • 靛基质试验（吲哚试验）
        • 红色——阴性
        • 无色——阴性
        • 肠杆菌科细菌的鉴定，大肠埃希菌多为阳性，沙门氏菌则为阴性
      • 硫化氢试验
        • 黑色沉淀——阳性
        • 无变化——阴性
        • 肠杆菌科属间的鉴定，沙门氏菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属的细菌大多为阳性
      • 脲酶试验
        • 红色——阳性
        • 不变色——阴性
        • 肠杆菌科中变形杆菌属的鉴定，也可用于幽门螺旋杆菌等的鉴定
      • 苯丙氨酸脱氨酶试验
        • 绿色——阳性
        • 无色——阴性
        • 肠杆菌科细菌鉴定。变形杆菌属、摩根菌属及普罗菲登斯菌属均为阳性，肠杆菌科的其他细菌都为阴性
      • 氨基酸脱羧酶试验
        • 紫色——阳性
        • 黄色——阴性
        • 赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸脱羧酶试验主要用于肠杆菌科细菌的鉴定
          • 沙门氏菌属中，除伤寒沙门氏菌和鸡沙门氏菌外，其他都为阳性
          • 志贺氏菌属中，宋内志贺氏菌、痢疾志贺氏菌1型、鲍氏志贺氏菌13型均为阳性，其他均为阴性
    • 碳源利用试验
      • 枸橼酸盐利用试验
        • 深蓝色——阳性
        • 绿色——阴性
        • 肠杆菌科细菌属间的鉴别
          • 沙门氏菌属、克雷伯菌属、枸橼酸杆菌属等——阳性
          • 埃希氏菌、志贺氏菌属——阴性
      • 丙二酸盐利用试验
        • 深蓝色——阳性
        • 绿色——阴性
        • 肠杆菌科细菌属间的鉴别
          • 克雷伯菌属——阳性，枸橼酸杆菌属、哈夫尼亚菌属及肠杆菌属中有的也呈——阳性
    • 酶类试验
      • 触酶（过氧化氢酶）试验
        • 产生大量气泡——阳性
        • 不产生大量气泡——阴性
        • 革兰氏阳性球菌的初步分类
          • 葡萄球菌、微球菌——阳性
          • 链球菌——阴性
      • 氧化酶（细胞色素氧化酶）试验
        • 立即出现红色，继而变为深红色至深紫色——阳性
        • 肠杆菌科细菌与假单胞细菌（非发酵菌）的鉴别
          • 肠杆菌科细菌——阴性
          • 假单胞菌、奈瑟菌属、莫拉菌属细菌——阳性
      • 凝固酶试验
        • 玻片法
          • 无自凝，菌液呈均匀混浊——阴性
          • 菌液聚集成团快或颗粒状——阳性
        • 试管法
          • 血浆凝固成胶冻状——阳性
          • 血浆能流动不凝固——阴性
        • 葡萄球菌的鉴定
      • 硝酸盐还原试验
        • 肠杆菌科细菌、假单胞菌、厌氧菌的鉴别
        • 肠杆菌科细菌、铜绿假假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌、伟荣球菌——阳性
      • DNA酶试验
        • 出现透明环——阳性
        • 无透明环——阴性
        • 葡萄球菌、沙雷菌、变形杆菌——阳性
      • 卵磷脂酶试验
        • 菌落周围形成乳白色混浊环——阳性
        • 厌氧菌的鉴定
          • 产气荚膜梭菌、诺维梭菌——阳性
      • 胆汁溶菌试验
        • 平板法
          • 菌落消失——阳性
        • 试管法
          • 加胆盐的菌液变透明，对照管仍混浊——阳性
        • 肺炎链球菌——阳性，甲型链球菌——阴性
      • CAMP试验
        • 链球菌属的鉴定
        • 结果
          • B群链球菌和金黄色葡萄球菌交界处出现箭头状溶血区——阳性
          • 无箭头状透明溶血区——阴性
    • 其他生化试验
      • 克氏双糖铁（KIA）试验
        • KIA琼脂含有：乳糖：葡萄糖=10:1
        • 接种针从深层向上提起，在斜面上由下至上划线
        • 结果
          • 斜面（K/A）、底层（Ｋ/A）、产气（+/-）、硫化氢（+/-）
          • （KA+-）——只分解葡萄糖而不分解乳糖
            • 志贺氏菌
          • （AA+-）——分解乳糖产酸
            • 大肠埃希菌
          • （KA-+）——葡萄糖发酵，乳糖不发酵，产生硫化氢
            • 沙门氏菌，普通变形杆菌
          • （KK--）——不发酵糖类
            • 粪产碱杆菌
        • 肠杆菌科细菌的鉴定和鉴别
      • 动力-靛基质-脲酶（MIU）试验
        • 接种线变宽、变模糊，培养基变混浊——动力试验阳性
        • 玫瑰红色——靛基质试验阳性
        • 桃红色——脲酶试验阳性
        • 与KIA试验共同用于肠杆菌科细菌的鉴定