第六章 芳酸类非甾体抗炎药分析

药物分析人卫第八版第六章芳酸类非甾体抗炎药分析知识梳理，包括药物结构、药物理化性质、含量测定、有关物质检查、药物鉴别等等。

第六章 芳酸类非甾体抗炎药分析

• 三 药物鉴别
  • 1.三氯化铁的鉴别方法
    • （1）水杨酸反应
      • 水杨酸在中性或弱酸性（pH4-6）条件下，与 FeCl3 生成紫堇色配位化合物。在强酸性溶液中配位化合物可分解；反应极为灵敏，试验宜在稀溶液中进行。
    • （2）酚羟基反应
      • 对乙酰对乙酰氨基酚具有酚羟基，可与三氯化铁试液反应显蓝紫色。
      • 吡罗昔康和美洛昔康上的烯醇式羟基具有酚羟基的性质，也可在三氯甲烷溶液中与三氯化铁生成红色配合物，分别显玫瑰红色和淡色红色。
  • 2.重氮化-偶合反应的鉴别方法
    • 凡是分子结构中含有芳伯氨基或潜在芳伯氨基的药物均可反应。 例如，贝诺酯（阿司匹林与对乙酰氨基酚相互酯化）和对乙酰氨基酚具有潜在芳伯氨基，加酸水解（水浴加热，放冷）后产生芳伯氨基结构，在酸性溶液中，与亚硝酸钠试液进行重氮化反应，生成重氮盐与碱性β-萘酚偶合生成橙红色沉淀。
  • 3.水解反应鉴别方法
    • 阿司匹林与碳酸钠试液加热水解得水杨酸钠及醋酸钠，加过量的稀硫酸酸化后则生成白色水杨酸沉淀，并发生醋酸的臭气
  • 4.元素反应：
    • (1） 氯原素：含氯药物与碱共热分解产生氯化物，显氯化物的鉴别反应。如双氯芬酸钠。
    • (2） 硫元素：美洛昔康中含有二价硫高温分解产生硫化氢气体，遇醋酸铅生成硫化铅黑色沉淀。
  • 5.缩合反应
    • 酮洛芬具有二苯甲酮结构，在酸性条件下可与二硝基苯肼缩合生成橙色偶氮化合物。
  • 6. 光谱法
    • （1）紫外-可见分光光度法
      • ①最大吸收波长法：双氯芬酸钠；
      • ②最大与最小吸收波长法：布洛芬；
      • ③吸光度法：甲芬那酸；
      • ④吸光度比值法：如二氟尼柳。
    • （2）红外分光光度法：本类药物的原料药均采用红外分光光度法鉴别。
  • 7.色谱法
    • ①薄层色谱法：如二氟尼柳、美洛昔康等制剂；
    • ②高效液相色谱法：多种制剂。
• 四 有关物质检查
  • 阿司匹林中游离水杨酸与有关物质的检查：
    • ①溶液的澄清度
      • 检查方法：取供试品 0.50g，加温热至约 45℃的碳酸钠试液 10ml 溶解后，溶液应澄清。该项检查系控制阿司匹林原料药中无羧基的特殊杂质的量。其原理是基于阿司匹林分子结构中含羧基，可溶于碳酸钠试液；而苯酚、醋酸苯酯、水杨酸苯酯及乙酰水杨酸苯酯等杂质不溶的特性。
    • ②游离水杨酸（特殊杂质）
      • 水杨酸对人体有毒性，其分子中所含的酚羟基易被氧化，在空气中生成有色的醒型化合物而使成品变色，因而需加以控制。现行版药典采用 HPLC 法，加 1%冰醋酸的甲醇溶液，以防阿司匹林的水解，按外标法以峰面积计算，游离水杨酸不得超过 0.1%。
    • ③有关物质
      • 阿司匹林中的“有关物质”系指除“游离水杨酸”外的其他合成副产物。“溶液的澄清度”可检查部分不含羧基的“有关物质”，为全面控制阿司匹林“有关物质”，采用 HPLC 法检查。
    • ④双水杨酯中游离水杨酸与有关物质的检查
      • 原理：水杨酸可以与三价铁生成有色配合物；
      • 方法：为避免双水杨酯的水解，ChP2015 以三氯甲烷为溶剂，采用水相萃取比色法检查。
  • 对乙酰氨基酚中有关物质的检查：
    • （1）对氨基酚的检查（特杂）：对乙酰氨基酚在合成过程中由于乙酰化不完全，或因贮藏不当发生水解，均可引入对氨基酚。对氨基酚毒性较大，且易被氧化变色而影响成品质量并引入进一步的杂质，必须严格加以控制。对氨基酚同时含有游离酚羟基和氨基，具有酸碱两性，在反相色谱条件下易出现峰拖尾或峰分裂现象，可使用离子对色谱法消除这一现象。采用离子对反相 HPLC 法检查。
    • （2） 对氯苯乙酰胺：对氯苯乙酰胺极性小，无法再同一色谱条件下一并检查。则将流动相中甲醇的比例由 10%提高到 40%，磷酸盐缓冲液-甲醇（60：40）；采用杂质对照品对照法，按外标法以峰面积计算，限量为 0.005%。
• 五 含量测定
  • 原料药的含量测定：除个别品种，如对乙酰氨基酚采用紫外-可见分光光度法、双氯芬酸钠与吡罗昔康采用非水溶液滴定法测定外，主要采用酸碱滴定法。包括直接滴定法和剩余量回滴法。
    • （1）直接滴定法：将药物溶于中性乙醇、甲醇或丙酮中，以酚酞﹑酚红或酚磺酞为指示剂，用氢氧化钠直接滴定。
      • ①原理 利用阿司匹林分子结构中的游离羧基具有一定的酸性，可与碱成盐的性质，用氢氧化钠滴定液直接滴定。反应式如下：
      • ②方法 取供试品约 0.4g，精密称定，加中性乙醇（对酚酞指示液显中性）20ml 溶解后，加酚酞指示液 3 滴，用氢氧化钠滴定液（0.1mol／L）滴定，每 1ml 氢氧化钠滴定液相当于 18.02mg 的阿司匹林。
      • 阿司匹林为有机酸，显弱酸性，用氢氧化钠滴定时，化学计量点偏碱性，故指示剂选用在碱性区变色的酚酞。同时为防止阿司匹林在测定过程中由于酯键的水解而使结果偏高，采用乙醇溶解样品，因乙醇对酚酞（指示剂）显微酸性，故将乙醇用氢氧化钠中和后使用。
    • （2）返滴定法：美洛昔康含有与羰基共轭的烯醇式羟基，具有羧酸性质，显一价酸性，亦可用氢氧化钠滴定液滴定。但由于本品在甲醇.乙醇及水中极微溶解或几乎不溶，在丙酮中微溶。所以，使用定量过量的氢氧化钠滴定液溶解后，用盐酸滴定液回滴定剩余氢氧化钠滴定液。
    • （3）水解后剩余量滴定法：阿司匹林的酯结构在碱性溶液中易于水解，直接滴定易引起偏差。采用本法：加入定量过量的氢氧化钠滴定液，加热使酯键水解后，再用酸滴定液回滴定剩余的氢氧化钠滴定液，可显著提高测定的准确度和精密度。
  • 药物制剂含量测定：除个别品种，如双水杨酯片的含量测定与原料药同法采用酸碱滴定法外，本类药物制剂的定量性检查与含量测定主要采用紫外-可见分光光度法与高效液相色谱法。
    • （1） 紫外-可见分光光度法
      • ①直接紫外-可见分光光度法：吡罗昔康与对乙酰氨基酚的主要剂型，以及双氯芬酸钠、吲哚美辛、美洛昔康部分剂型与尼美舒利片的含量测定均采用本法。
      • 对乙酰氨基酚结构中有苯环，在碱性溶液中，在 257nm 波长处有最大吸收。《中国药典》采用紫外－可见分光光度法测定含量。
      • 方法：取本品约 40mg，精密称定，置 250ml 量瓶中，加 0.4％氢氧化钠溶液 50ml 溶解后。加水至刻度，摇匀，精密量取 5ml，置 100ml 量瓶中，加 0.4％氢氧化钠溶液 10ml，加水至刻度，在 257nm 的波长处测定吸光度，按对乙酰氨基酚的吸收系数（E）为 715 计算，即得。
      • ②柱分配色谱-紫外分光光度法：USP37-NF32 则采用柱色谱分离法消除阿司匹林丸剂、胶囊和栓剂中辅料及降解产物的干扰。
    • （2） HPLC：典型芳酸类非甾体抗炎药物制剂大多采用离子抑制-反相高效液相色谱法测定，用外标法计算含量。
      • 使用 ODS 柱（十八烷基硅烷键合硅胶填料），本法为反相离子抑制色谱，流动相中添加冰醋酸是为抑制阿司匹林的解离，进而消除因色谱柱对阿司匹林的吸附而造成的色谱峰拖尾与分裂现象，也可抑制阿司匹林的水解，增加溶液的稳定性。
      • （双相滴定法：即采用两种互不相溶的溶剂在分液漏斗中进行的滴定。如苯甲酸钠的双相滴定法：苯甲酸溶于有机溶剂，不溶于水；苯甲酸钠溶于水，不溶于有机溶剂。若以水为溶剂，则析出的苯甲酸干扰滴定终点的 pH 突跃，因此水相中加入于水互不相溶的有机溶剂，如乙醚，提取反应生成物苯甲酸，使反应定量完成，同时避免了苯甲酸在瓶中影响终点的观察。）
• 二 药物理化性质
  • (1）酸性
    • 本类药物因分子结构中具有游离羧基而显酸性，但其酸性强度受苯环的取代位置及苯环上其他取代基的影响。
      • 具有邻位取代苯甲酸结构的药物，如阿司匹林、二氟尼柳，由于邻位效应使得酸性增强。水杨酸还由于邻位游离羟基的氢能与羧基形成分子内氢键，更增强了羧基中氧氢键的极性，使其酸性进一步增强；
      • 双氯芬酸、布洛芬、吲哚美辛等，由于羧基并非直接与苯环相连，在结构上属于芳环取代的脂肪酸类，其酸性较弱；
      • 而美洛昔康、尼美舒利、对乙酰氨基酚则为酰胺结构，无明显酸性。
  • (2）水解性
    • 本类药物中，阿司匹林具有酯键，吲哚美辛、美洛昔康、尼美舒利、对乙酰氨基酚等则具有酰胺键，均可发生水解反应。
  • (3）吸收光谱特性
    • 本类药物分子结构中具有苯环和特征取代基，均具有紫外和红外特征光谱。
  • (4）基团或元素特性
    • 本类药物分子结构中的特征基团或元素具有特征的理化特性，如对乙酰氨基酚的酚羟基与三价铁可生成有色配位化合物；
    • 美洛昔康结构中的硫元素热分解后产生的硫化氢可与醋酸铅生成黑色硫化铅等均可用于本类药物的鉴别。
• 一 药物结构