导图社区 细胞生物学2细胞生物学研究方法
电子显微镜与光学显微镜的基本区别、电子显微镜的有效放大倍数与分辨本领、电子显微镜的基本构造、有效放大倍数：10^6，如果通过光学手段继续放大，再也不会得到任何有意义的信息
插入细胞微电极便可测出细胞质膜两侧各种带电物质形成的电位差的总和，即膜电位、细胞质膜内外相对稳定的电势差，质膜内为负值，质膜内为正值，这种现象称为极化。
作用：只能插入磷脂分子之间，参与生物膜的形成。胆固醇与甘油磷脂相互作用会增加磷脂分子的有序性及脂双层的厚度，但对鞘磷脂没有明显的影响。
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细胞生物学研究方法
细胞形态构造的观察方法
分辨率
肉眼0.2mm
光学显微镜0.2μm
电子显微镜0.2nm
光学显微镜
普通复式光学显微镜
组成部分
光学放大系统
两组玻璃透镜
目镜
物镜
照明系统
光源
聚光镜
（有时）滤光片，控制波长范围
镜架及样品调节系统
最重要的性能参数：分辨率D
分辨率（resolution）：分辨率是指能区分开两个质点间的最小距离
D、光源波长λ、物镜镜口角α、介质折射率N：D=0.61λ/N·sin(α/2)
α最大值可达140°
最短可见光λ=400nm
N
空气中1
油镜1.5
经计算，最大分辨率为0.2μm
观察对象
单细胞生物或体外培养细胞
直接观察
生物组织样品
固定
常用固定剂：甲醛
包埋
常用包埋剂：石蜡
染色
苏木精-伊红染色（H-E染色）
苏木精：碱性染料，结合细胞核
伊红：酸性染料，结合细胞质
观察
蓝紫色细胞核
红色细胞质
相差显微镜和微分干涉显微镜
相差显微镜（phase-contrast microscope）
观察对象：可观察活细胞结构
原理
当两束光通过光学系统时，会发生相互干渉。如果它们的相位相同，干涉的结果是使光的振幅增大，亮度增强。反之就会相互抵消亮度变弱。
相差显微镜和干涉差显微镜利用此原理增强样品反差，从而实现对非染色活细胞观察
光线在不同密度物质中滞留时间不同，因而光程或相位发生了不同程度的改变
在普通光学显微镜基础上，增加了“环状光阑”和在物镜后焦面上的“相差板”，从而可将这种光程差或相位差，通过光的干涉作用，转换成振幅差
微分干涉显微镜（differential-interference microscope）
观察对象：适于研究活细胞
原理：以偏振光为光源，光线经棱镜折射后分成两束，在不同时间经过样品的相邻部位，然后再经过另一棱镜将这两束光汇合，从而使样品中厚度上的微小区别转化成明暗区别
接上高分辨率录像装置，就可以用来观察并记录活细胞中的颗粒及细胞器的运动
计算机辅助的微分干涉显微镜可以观察到一些常规光学显微镜难于观察的一些显微结构。应用这一原理制备的录像增差显微镜可以用来直接观察颗粒物质沿着微管运输的动态过程
荧光显微镜
观察对象：对细胞内特异的蛋白质、核酸、糖类、脂质以及某些离子等组分进行定性定位研究
核心部件
滤光片系统
激发滤光片
通过激发滤光片的短波长的激发光，照射标记在样品中的荧光分子上，使之产生一定波长的光即荧光
阻断滤光片
专用的物镜镜头
荧光显微镜样品制备技术
免疫荧光技术
荧光素直接标记技术
举例：荧光染料DAPI特异性地直接与细胞中的DNA相结合，从而显示出细胞核或染色体在细胞中的定位
应用
细胞内动态变化的研究
用标记荧光素的肌动蛋白观察肌动蛋白分子组装成肌动蛋白纤维
绿色荧光蛋白基因与某种蛋白基因相融合，可在表达这种融合基因的活细胞中，观察到该蛋白质的动态变化
激光扫描共焦显微镜（laser scanning confocal microscope，LSCM）
构造：相当于在荧光显微镜上安装了一套激光共焦成像系统，并以激光为光源，从而，极大地提高了图像的分辨率
原理：共焦是指聚光镜和物镜同时聚焦到同一点上，因而只有聚光镜聚焦在样品中的某一位点上所产生的激发荧光才能清晰成像，，而来自焦平面以外的散射光则被小孔或狭缝挡住，再利用激光扫描装置和计算机高速采集与处理会聚每一个点上的的信息，形成一幅清晰的二维图像
比普通荧光显微镜提高1.4-1.7倍
纵向分辨率得到很大改善，可以通过“光学切片”即改变焦点获得一系列不同切面上的细胞图像，经叠加后重构出样品的三维结构
超高分辨率显微术
全内反射荧光显微术
基于单分子成像技术的PALM/STORM方法
基本原理：
4π和STED显微术
结构照明显微术
电子显微镜
电子显微镜的基本知识
电子显微镜与光学显微镜的基本区别
分辨本领
光：200nm
电：0.2nm
光：可见光（波长400-760nm）
电子束（波长0.01-0.9nm）
透镜
光：玻璃透镜
电：电磁透镜
真空
光：不要求真空
电：真空
成像原理
光：利用样本对光的吸收形成明暗反差和颜色变化
电：利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差
电子显微镜的有效放大倍数与分辨本领
有效放大倍数：10^6，如果通过光学手段继续放大，再也不会得到任何有意义的信息
分辨本领：电镜处于最佳状态下的分辨率
电子显微镜的基本构造
电子术照明系统
电子枪
成像系统
物镜、中间镜、投影镜等
真空系统
记录系统
主要电镜制样技术
超薄切片技术（ultrathin section）
目的：保持样品的真实性
要求
样品的形态和精细结构不发生改变
细胞内部的成分保持在原来的位置上，甚至其免疫原性尽可能的不发生改变
方法
化学法
固定剂：戊二醇和四氧化锇OsO4
物理法
保存细胞的超微结构，如超低温冷冻
操作注意
动物的处死和取材都要快速进行，以防细胞自溶作用造成的损伤
固定的样品块直径一般小于1mm，以便固定剂迅速渗透
目的：保证在切片的过程中，包埋介质能均匀良好地支撑样品，以便获得连续、完整并有足够强度的超薄切片
介质要求
具有良好的机械性能以利于切片
在聚合过程中，不要发生明显的膨胀与收缩
观察样品时，易被电子穿透并能耐受电子轰击
在高倍放大的图像中不显示本身结构等特征
常用包埋剂：各种环氧树脂
注意事项：生物样品固定后含有大量水分，而包埋剂多具疏水性质，因此固定的样品在包埋前通常要经历一系列的脱水处理
切片
厚度：40-50nm
切片刀：玻璃或钻石，最常使用的是玻璃刀
重金属盐染色
电镜下观察到的为黑白图像
负染色技术（negative staining）
观察对象：经纯化的细胞组分或结构，如线粒体基粒、核糖体、蛋白颗粒及细胞骨架纤维甚至病毒
分辨率：可达1.5nm
原理：负染色是用重金属盐，如磷钨酸或醋酸双氧铀溶液对铺展在载网上的样品进行染色。吸去多余染料，样品自然干燥后，整个载网上都铺上了一薄层重金属盐，从而衬托出样品的精细结构
冷冻蚀刻技术（freeze etching）
步骤
冷冻断裂
用快速低温冷冻法，在液氮或液氦中将样品迅速冷冻，然后在低温下进行断裂
蚀刻复型
用铂等重金属进行倾斜喷镀，以形成对应于凹凸断裂面的电子反差
用碳进行垂直喷镀，在断裂面上形成一层连续的碳膜
用消化液把生物样品消化掉，将复型膜移到载网上，并在电镜下进行观察
优点
主要用来观察膜断裂面上的蛋白质颗粒和膜表面形貌特征，图像富有立体感，样品不需包埋甚至也不需要固定，因而能更好地保持样品的真实结构
电镜三维重构与低温电镜技术
扫描电镜技术（scanning electron microscope，SEM）
原理：电子枪发射出的电子束被磁透镜会聚成极细的电子“探针”，在样品表面进行“扫描”，激发样品表面放出二次电子、背散射电子等。二次电子由探测器收集并被闪烁器转变成光信号，其产生的多少与样品表面的形貌相关。这样，通过扫描电镜可以得到样品表面的立体图像信息
注意事项：为了保证样品在扫描观察前不发生表面变形，通常需要利用CO2临界点干燥法对样品进行干燥处理
扫描隧道显微镜（scanning tunnel microscope，STM）
原理：量子力学中的隧道效应。通常在低电压下，二电极之间具有很大的阻抗，阻止电流通过，称之为势垒；当二电极之间近到一定距离时，电极之间产生了电流，称隧道电流，这种现象称为隧道效应
特点
具有原子尺度的高分辨本领，侧分辨率为0.1-0.2nm，纵分辨率可达0.001nm
可以在真空、大气、液体等多种条件下工作，这一点在生物学领域的研究中尤为重要
非破坏性测量，因为扫描时不接触样品，又没有高能电子束轰击，基本上可避免样品的形变
模式生物与功能基因组研究
病毒
外源基因载体
大肠杆菌
基因表达调控 操纵子学说建立 分子生物学
酵母
细胞周期调控 遗传
线虫（遍体透明）
细胞凋亡机制 分裂分化死亡
果蝇
遗传定律 染色体
斑马鱼
胚胎发育
小鼠
哺乳动物功能基因组学
拟南芥
植物功能基因组学
细胞及生物大分子的动态变化
荧光漂白恢复技术（fluorescence photobleaching recovery，FPR）
定义：使用亲脂性或亲水性的荧光分子，如荧光素、绿色荧光蛋白等与蛋白或脂质偶联，用于检测所标记分子在活体细胞表面或细胞内部的运动及其迁移速率
利用高能激光束照射细胞的某一特定区域，使该区域内标记的荧光分子发生不可逆的淬灭，这一区域称为光漂白区
由于细胞中脂质分子或蛋白分子的运动，周围非漂白区的荧光分子不断向光漂白区移动，结果使光漂白区的荧光强度逐渐地恢复到原有水平，这一过程称为光恢复
给出活细胞内脂质或蛋白质运动的定性的结果
获得某些定量的信息
膜脂分子的扩散系数
蛋白质的迁移率
酵母双杂交技术（yeast two-hybrid）
酵母双杂交系统：一种利用单细胞真核生物酵母在体内分析蛋白质-蛋白质相互作用的烯酮
理论基础
细胞基因的转录需要转录激活因子
DNA结合域（DB）：识别DNA上的特异转录调控序列并与之结合
转录激活域（AD）：与其他成分作用形成转录复合体
实验方法
目的：证明靶蛋白A是否与搭档蛋白B相互作用/寻找与蛋白A可能发生作用的蛋白
设计实验
制备DB蛋白A结合的融合蛋白（“诱饵”）
制备AD与蛋白B或可能与蛋白A发生作用的蛋白的融合蛋白（“猎物”）
判断方法
若发生作用，则可形成与转录激活因子类似的具有DB与AD结构域的复合物，启动报告基因的表达
反之，报告基因不表达
高灵敏度
在活细胞内研究蛋白质相互作用的实验技术，既可用于哺乳动物，也可以用来研究高等植物之间的相互作用 举例：细胞信号转导网络
缺陷：猎物可能与诱饵出现非特异性结合的问题，出现假阳性
荧光共振能量转移技术fluorescence resonance energy transfer，FRET
应用：检测活细胞内两种蛋白质分子是否直接相互作用
一定波长激发光，携带发光基因A的供体分子可被激发荧光A，而不能激发携带发光基团B的受体分子发出荧光B
当荧光光谱A与受体的发光基团的吸收光谱B相互重叠，并且两个发光基团的距离小到一定程度时，就会发生不同程度的能量转移现象，可观察到受体发出的荧光B，这种现象称为FRET
当两个蛋白质分子距离在10nm之内，就可能发生FRET现象，由此认为两个蛋白质存在直接的相互作用
举例
实验过程
实验准备
青色荧光蛋白CFP基因融合供体蛋白基因
黄色荧光蛋白YFP基因融合受体蛋白基因
融合蛋白距离大于10nm
CFP蓝色荧光
融合蛋白距离5-10nm
可激发YFP黄色荧光
判断：测量CFP荧光强度的损失量
反映细胞内两种蛋白相互作用的可能性与作用的强弱
放射自显影技术（autoradiography）
定义：利用放射性同位素的电离射线对乳胶（含AgBr或AgCl）的感光作用，对生物大分子进行定性、定位与半定量研究的一种细胞化学技术
两个主要步骤
同位素标记的生物大分子前体的掺入
细胞内同位素所在位置的显示
研究DNA合成
氢3标记的T脱氧核苷
研究RNA合成
氢3标记的U核苷
含硫蛋白质代谢
硫35蛋氨酸或半胱氨酸
蛋白质合成
氢3或碳14标记的蛋氨酸、亮氨酸等
显微放射自显影基本实验步骤
用合适的放射性前体分子标记机体或细胞，根据实验的需要，按标记的持续时间和脉冲标记
标记后的组织与细胞按常规方法制片，在暗室中向样品表面均匀地敷一层厚3-10um的乳胶膜
在暗盒中曝光数天，再经显影、定影后于显微镜下观察
细胞中银颗粒所在的部位即代表放射性同位素的标记部位
细胞培养与细胞工程
细胞培养
动物细胞培养
细胞种类
原代细胞（primary culture cell）：从机体中取出后立即培养的细胞
传代细胞（subculture cell）：进行传代培养后的细胞即称为传代细胞
原代细胞培养
过程
取出健康动物的组织块，剪碎
用浓度与活性适中的胰酶或胶原酶与EDTA（螯合剂）等将细胞连接处消化使其分散
给予良好的营养液与无菌的培养环境（接近体温与体内pH），在培养中进行静置或慢速转动培养，要加一定量的小牛（或胎牛）血清，这样细胞才能更好贴壁生长
单层细胞培养
传代10代左右
大部分：衰老死亡
极少数：存活，细胞系（ cell line）
50代
停止：有限细胞系（finite cell line）
遗传突变，有癌细胞特点，无限复制：永生细胞系（infinite cell line）
细胞克隆与细胞株（cell strain）
细胞克隆：用单细胞克隆培养或通过药物筛选的方法从某一细胞系中分离出单个细胞，并由此增殖形成的、具有基本相同的遗传性状的细胞群体
细胞株：上述细胞群体经过生物学鉴定，如具有特殊的遗传标记或性质，这样的细胞系可以称为细胞株
植物细胞培养
常用单配体培养，如花药
原生质体培养
对象：植物的体细胞（二倍体）
纤维素酶去除细胞壁，去壁的细胞称为原生质体
原生质体在无菌培养基中生长分裂，经过诱导分化最终可长成植株
也可用不同植物的原生质体进行融合与体细胞杂交，由此获得体细胞杂交的植株
细胞工程（cell engineering）
细胞融合与单克隆抗体技术
细胞融合cell fusion
定义：两个或多个细胞融合成一个双核或多核细胞的现象
介导动物细胞融合常用的促融剂或方法，植物细胞需先去细胞壁
灭活的病毒
化学物质
电融合技术（electrofusion method）
单克隆抗体（monoclonal antibody）
1984年诺贝尔生理或医学奖：B淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体
实验前提
B淋巴细胞
产生抗体
体外难以增殖
TK或HGPRT缺陷型骨髓瘤细胞
不分泌抗体
体外无限传代
在含氨基蝶呤的培养液内不能成活
实验对象
小鼠骨髓瘤细胞
经绵羊红细胞免疫过的的小鼠脾细胞（B淋巴细胞）
实验方法：聚乙二醇或灭活病毒的介导下发生融合
杂交细胞特点
可分泌抗绵羊红细胞的抗体
可在体外条件下或移植到体内无线增殖
可在含HAT的培养液内通过旁路合成核酸而得以生存
优点：可以用混合型的异质抗原制备出针对某单一性抗原分子上特异决定簇的同质性单克隆抗体
作用
与基因克隆技术相结合为分离和鉴定·新的蛋白质和基因开辟了一条广阔途径
在临床诊断与肿瘤等疾病的治疗中也具有重要作用
显微操作技术与动物的克隆
细胞拆合
定义：把细胞核与细胞质分离开来，然后把不同来源的胞质体和核质体相互组合，形成核质杂交细胞
用机械方法或短波光把细胞核去掉或使之失活
用微吸管吸取其他细胞的核，注入去核的细胞质中
细胞松弛素B处理细胞，细胞出现排核现象
离心，将细胞拆分为核质体和胞质体两部分
显微操作（micromanipulation）
定义：在显微镜下，用显微操作装置对细胞进行解剖和微量注射的技术
功能
核移植
对细胞核进行解剖和向核内注入基因
细胞及其组分的分析方法
用超离心技术分离细胞组分
差速离心
原理：利用不同的离心速度所产生的不同离心力，将各种质量和密度不同的亚细胞组分和各种颗粒分开
密度梯度离心
原理：将要分离的细胞组分小心地铺放在含有密度逐渐增加的、高溶解性的惰性物质形成的密度梯度溶液表面，通过重力或离心力的作用使样品中不同组分以不同沉降率沉降，形成不同的沉降带。各组分的沉降率与它们的形状和大小有关，通常以沉降系数（S值）表示
分类
速度沉降
用于分离密度相近而大小不一的细胞组分
等密度沉降
分离不同密度的细胞组分
举例：DNA半保留复制同位素标记法
特异蛋白抗原的定位与定性
细胞内蛋白质分子定位
将免疫学方法（抗原-抗体特异结合）与荧光标记技术相结合用于研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法
直接免疫荧光技术
将荧光分子与抗体偶联后直接用于免疫标记技术
间接免疫荧光技术
先将抗体（第一抗体）与抗原反应，然后再加入与荧光分子相偶联的的抗第一抗体的抗体（第二抗体）
荧光抗体的制备
标本的处理
方法：组织切片、冷冻切片、整装细胞
宗旨：尽量完好地保持被检测蛋白质的抗原性
免疫染色
抗原-抗体反应
注意事项：注意设立各种实验对照以保证结果的可靠性
观察记录
其他技术
免疫酶标记技术：以酶（如辣根过氧化物酶）代替荧光素与抗体偶联
免疫电镜技术
优缺点
优点：快速、灵敏、特异性强
缺点：分辨率有限
分类：与抗体结合的标志物不同
免疫铁蛋白技术
免疫酶标技术
免疫胶体金技术
在电镜下金颗粒容易识别
可以制成5nm、10nm或20nm等不同直径的金颗粒，用以双重标记或多重标记
样品制备
程序：固定、包埋、超薄切片制备、免疫标记、染色等
关键
保持样品中蛋白的抗原性
尽量保存样品的精细结构
蛋白体外分析定性
免疫印迹（western blotting）
细胞内特异核酸的定位与定性
原位杂交（in situ hybridization）
定义：用标记的核酸探针通过分子杂交确定特异核苷酸序列在染色体上或在细胞中的位置的方法称为原位杂交
放射性同位素标记探针 放射自显影
荧光素标记探针 荧光显微镜
生物素等小分子标记探针
细胞成分的分析与细胞分选技术
流式细胞术（flow cytometry）
细胞群体一般需要分散后对待测的某种成分进行特异的荧光染色，然后使悬液中的细胞一个个快速通过流式细胞仪。
当含有单个细胞的液滴通过激光束时，带有不同荧光的细胞所在的液滴被充上正电荷、负电荷，或不被充电，同时检测器可测出并记录每个细胞中的待测成分的含量。
因带有不同表面标志的细胞中所带的电荷的种类不同，当液滴通过高压偏转板时，带不同电荷的液滴发生偏转，从而达到将细胞分选的目的
定量地测定某一细胞中的DNA、RNA或某一特异的标记蛋白的含量，以及细胞群体中上述成分含量不同的细胞的数量
将某一特异染色的细胞从数以万计的细胞群体中分离出来
将DNA含量不同的中期染色体分离出来
细胞的分选
