导图社区 基因分析技术（A）
这是一篇关于基因分析技术（A）的思维导图。随着分子生物学融合到医学研究和临床诊断与治疗的各个方面,基因,已经成为大家最为熟悉的字眼,基因与疾病,基因与健康的关系也成为热门的研究领域.
这是一篇关于基因分析技术（B）的思维导图。随着分子生物学融合到医学研究和临床诊断与治疗的各个方面,基因,已经成为大家最为熟悉的字眼,基因与疾病,基因与健康的关系也成为热门的研究领域.
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基因分析技术（A）
分子杂交
检测和鉴定核酸分子的方法 涉及标记的核酸探针和未标记的靶DNA/RNA进行碱基互补配对
探针
一段与目的基因或DNA/RNA片段特异杂交的核苷酸序列
探针可以是整个基因，也可以是一部分基因
一般通过DNA克隆或化学方法合成，并用一定方法标记
工作的时候必须是单链（“上岸第一剑，先斩意中人”），双链探针需要加热变为单链
种类
DNA探针
通常为双链，分离自细胞DNA克隆或PCR DNA克隆
RNA探针
通常为单链，插入克隆型载体的DNA片段经过脱逸转录制备
寡核苷酸探针
通常为单链，化学合成
标记
切口平移法
胰DNase I：打开切口（随意切割磷酸二酯键）
E coli DNA聚合酶I
5’~3’外切：切除旧的核苷酸
5’~3’聚合：新换旧，用dNTP向上加，只要有一个dNTP被标记则新合成链就会被标记
随机引物延伸法
人工合成六核苷酸引物，在有引物的条件下变性和退火
E coli DNA聚合酶的Klenow亚单位只催化5’~3’的聚合方向
DNA末端标记法
激酶末端标记（放射性同位素磷置换）
填充式末端标记（Klenow亚单位）
32P常用于Southern印迹杂交和斑点杂交
RNA探针标记
标记探针分子
放射性同位素
非同位素
生物素
链霉亲和素系统
地高辛系统
荧光基团
Southern印迹杂交
通过标记探针的DNA单链与互补待测的靶DNA单链结合形成异源双链，检测待测靶DNA是否存在与探针同源的DNA序列，DNA-DNA Hybrid
具体步骤
1.提取组织或细胞DNA
2.限制酶消化DNA片段
3.电泳分离
4.变相转移至固定支持膜
5.标记探针、变性
转移到碱性纤维素膜或者尼龙膜上
6.杂交、洗膜
7.放射自显影
8.结果分析
凝胶电泳
用于分离不同大小的DNA片段（0.1kb~20kb的看涌动速率）
琼脂糖凝胶的滤过性
实际应用：镰状细胞贫血诊断
具体步骤见书P31
简单来说就是有个酶叫MstII，不突变它能给片段铰成两段，突变了铰不了了
Northern印迹杂交
Southern印迹杂交的一个变种
通过标记的探针DNA单链与互补的待测靶mRNA单链结合形成异源双链，检测待测靶DNA是否有与探针同源的mRNA序列，属于DNA-RNA Hybrid
与Southern印迹杂交的不同之处
一般不需要限制性内切酶消化
靶RNA在变性凝胶电泳中变性
实际应用
mRNA结构分析
mRNA含量分析（灰度扫描）
Western印迹杂交
又称免疫印迹杂交
运用生产的抗体来检测待测样品是否含有能与抗体结合的蛋白质（待测产物作为抗原）
步骤
1提取组织或细胞总蛋白
2电泳分离
3转膜
4抗原-抗体杂交
5洗膜
6显带
染色：考马斯蓝、银染
7结果分析
应用
比较基因表达程度
斑点杂交
是DNA杂交，用于未分类的核酸标本
直接将靶DNA的溶液置于膜上
干燥后变性处理
将膜置于含有标记的探针溶液中
洗膜，干燥，放射自显影
快速筛查等位基因间单一核苷酸的差异
PCR技术
聚合酶链反应，体外DNA扩增技术
原理
设计合成引物：结合于靶序列两端的寡核苷酸序列
必须有DNA合成引物（4种dNTP）（决定扩增产物特异性的最主要因素）
必须有DNA聚合酶（耐热的Taq的酶）
PCR是链式反应：变性→复兴→延伸
PCR反应体系
模板DNA
一对引物
4种dNTP
Taq酶
缓冲液
重组DNA技术
限制酶（限制性核酸内切酶）
特异性切断DNA链内的磷酸二酯键
主要分为I/II/III型，II型限制酶酶切位点在识别序列内部，可以用于DNA重组技术
命名依据
属名：细菌属名的第一个字母
种名：细菌种名的前两个字母
菌株名
酶的序号
识别序列
4~6bp的回文结构
8bp+的回文结构
切割形式和结果
对称轴切割-平末端
交错切割-粘性末端
限制片段末端的连接
DNA连接酶连接互补的粘性末端
T4连接酶连接平末端
在DNA片段末端加上一个人工多核苷酸接头，使其变成粘性末端，再用DNA连接酶连接
载体“DNA搬运工”
将外源DNA片段运送到受体细胞，并能进行自我复制增殖和表达的工具
特征
分子质量小，便于与较大的DNA片段结合，能进入受体细胞并在其中增殖
有多种限制酶切位点，但对于一种酶只能有一种酶切位点
被切割载体DNA插入外源DNA后，不影响自身的表达和复制能力
载体上要有可选择的标记基因或报道基因，以利于在受体细胞中被选出
克隆载体上要有复制起点，表达载体上要有启动子
克隆载体
外源DNA片段，增殖扩大拷贝
质粒：细菌和简单核细胞独立于染色体外的闭环双链DNA分子
片段小
多克隆位点
抗性基因
复制起始点
λ噬菌体：可在体外独立包装的病毒，可以在细菌体内复制中等长度的DNA片段
具有12bp长的单链互补序列端：cos序列
置换型λ载体：基因组文库构建
插入型λ载体：cDNA文库构建
黏粒：将λ噬菌体的“cos序列”插入质粒
P1噬菌体
细菌人工染色体：重组质粒，能再细菌胞内繁殖，能克隆长达300kb的DNA大片段
酵母人工染色体：在酵母中繁殖的克隆载体，用来复制很大的DNA片段（几种载体中最大的）
容量：质粒＜λ噬菌体＜黏粒＜细菌人工染色体（BAC）＜酵母人工染色体（YAC）
表达载体
外源基因，产生蛋白质
细胞DNA克隆
使重组DNA分子在宿主细胞中表达扩增而获得大量相同的DNA片段
从细胞分离目的基因DNA和载体DNA，分别纯化
用相同的限制酶进行切割，获得具有相同黏性末端的DNA片段
退火连接构建重组DNA分子
最后导入宿主细胞
构建重组DNA分子
将靶DNA片段与载体连接
转化
将重组DNA分子转入受体细胞
细胞克隆的选择繁殖
细胞扩增
重组的DNA在单个细胞内可扩增为高拷贝
分离重组DNA克隆（最复杂）
DNA克隆的基本方法
分离基因组DNA，在细胞中进行克隆
由特定的mRNA反转录合成cDNA后进行克隆
化学合成目的基因进行克隆
PCR进行体外扩增进行DNA克隆
基因文库
基因组文库
人类和哺乳类动物的有核细胞有许多相同的DNA，可从易于获得的细胞（如血细胞）制备基因组DNA文库
cDNA文库
从特定的组织或胚胎发育的特定阶段的细胞分离poly（A）+mRNA，用反转录酶将poly（A）+mRNA反转录为双链cDNA，经限制酶切割后与载体重组，用适当的方式在宿主细胞中表达扩增
染色体特异的基因文库
