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疾病的病理学诊断和研究方法
病理学学习的目的是通过对上述内容的了解来认识和掌握疾病本质和发生发展的规律，为疾病的诊治和预防提供理论基础。
编辑于2022-11-01 11:00:21 广东- 相似推荐
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疾病的病理学诊断和研究方法
概述
（一）定义
通过对活体组织、细胞病理学标本和尸体解剖进行病理学检查
根据临床表现、手术所见、肉眼变化和镜下特征甚至分子免疫与遗传标记等综合分析
有时尚需结合特殊检查、随访结果
最后对疾病作出诊断病理学诊断
为临床确定疾病诊断
制订治疗方案
评估疾病预后
总结诊治经验等
在疾病预防和法医学中也起重要作用
（二）病理学诊断和研究最经典、最基本方法
随着生物医学新技术的快速发展与广泛应用，一些新的先进技术手段已经应用在疾病的研究和病理学诊断中。
肉眼的大体观察
光学显微镜水平的形态学研究方法
第一节 大体、组织和细胞病理学技术
（一）大体观察
运用肉眼或辅以放大镜、量尺和磅秤等工具
大体观察不仅是病理医师的基本功和正确病理诊断的第一步，也是医学生学习病理学的主要方法之一。
对大体标本的病变性状（形状、大小、重量、色泽、质地、界限、表面及切面形态、与周围组织和器官的关系等）进行细致的剖检、观察、测量、记录和取材，必要时可摄影留作资料
（二）组织病理学观察
将肉眼确定为病变的组织取材后
以福尔马林（甲醛）溶液固定和石蜡包埋制成组织切片
经不同方法染色后用光学显微镜观察
通过分析、综合病变特点，作出疾病病理学诊断
组织切片最常用染色方法是苏木素-伊红（HE）染色
迄今，这种传统的方法仍然是诊断和研究疾病最基本和最常用的方法。若仍不能作出诊断或需要进一步研究时，则可辅以组织化学染色、免疫组织化学和其他观察技术。
（三）细胞病理学观察
1、采集病变处细胞，涂片染色进行观察和诊断，细胞来源
运用各种采集器在口腔、食管、鼻咽部、女性生殖道等病变部位直接采集的脱落细胞
自然分泌物（如痰液）体液（如胸膜腔积液）及排泄物（如尿液）中的细胞
通过内镜采集的细胞或用细针穿刺（FNA）病变部位（如乳腺、甲状腺、淋巴结等）所吸取的细胞
2、细胞学检查还用于肿瘤的筛查
该方法操作简便，患者痛苦少，易于接受，但最后确定是否为恶性病变尚需进一步经活检证实。
3、细胞学检查还可用于对激素水平的测定（如阴道脱落细胞涂片检查）等
（四）液体活检技术
1、定义：指通过采集患者外周血等样本进行可反映肿瘤分子谱特征的检测技术
2、临床液体活检主要研究对象
液体活检技术在肿瘤的早期诊断、疗效监测、预后评估及个体化治疗中具有重要的临床意义。
（1）循环肿瘤细胞（CTCs）
CTCs指由实体瘤或转移灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞
1）大部分肿瘤细胞进入循环系统后被免疫系统识别并清除
2）少量肿瘤细胞会获得新特征而在血循环中存活
这些细胞即是CTCs
（2）循环肿瘤DNA（ctDNA）
ctDNA是指原发肿瘤、转移灶中凋亡与坏死的肿瘤细胞或CTCs中的游离DNA
ctDNA是特征性的肿瘤生物标记物
第二节 组织化学与免疫组织（细胞）化学技术
（一）组织化学
1、定义
一般称为特殊染色，通过应用某些能与组织或细胞的化学成分进行特异性结合的显色试剂
显示病变组织、细胞特殊化学成分（如蛋白质、酶类、糖类、脂类等）
同时又能保存组织原有形态改变，达到形态与代谢结合
例如
用苏丹Ⅲ染色显示细胞内的脂肪滴
普鲁士蓝染色显示含铁血黄素颗粒等
2、特殊染色在肿瘤的诊断和鉴别诊断中也可起辅助作用
如采用过碘酸 Schiff反应（PAS）染色可区别
骨Ewing肉瘤
含有糖原而呈阳性
恶性淋巴瘤
不含糖原呈阴性
（二）免疫组织化学（IHC）与免疫细胞化学（ICC）
概述
（1）定义
利用抗原抗体特异性结合反应以检测和定位组织或细胞中的某种化学物质
由免疫学和组织化学相结合而形成
（2）特点
1）IHC不仅敏感性和特异性较高
2）对被检测物质进行定量分析
可将形态学改变与功能及代谢变化相结合，直接在组织切片、细胞涂片或培养细胞爬片上原位显示某些蛋白质或多肽类物质，并可精确到亚细胞结构水平，结合电子计算机图像分析技术或激光扫描共聚焦显微技术等
1.IHC染色方法和检测系统
（1）染色方法
按标记物的性质
荧光法（荧光素标记）
酶法（辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等）
免疫金银法等
按染色步骤
直接法（又称一步法）
间接法（又称二步、三步或多步法）
按结合方式
抗原抗体结合
PAP法
标记的葡聚糖聚合物（LDP）法（最常用）
两步LDP法即 Envision法具有省时、操作简便、受内源性生物素干扰少等优点
亲和连接
ABC法
标记的链亲和素-生物素（LSAB）法（最常用）
（2）免疫组化染色常用检测显示系统
最常用是辣根过氧化物酶（HRP）-二甲基联苯胺（DAB）系统
阳性信号呈棕色细颗粒状
2.IHC染色的结果判读
IHC中常见的抗原表达模式
细胞膜线性阳性反应
大多数淋巴细胞分化抗原、钙粘连蛋白等
细胞质阳性反应
根据抗原亚细胞结构定位不同，又有数种表现形式
1>细胞角蛋白（CK）、肝细胞特异性蛋白（Hep Par--1）以及一些中间丝蛋白主要分布在近细胞膜处胞质内
2>CD15和CD30等抗体的染色呈胞质内局限性点状阳性反应
3>BCL-2蛋白等定位于线粒体的抗原常表现为细胞质内弥漫性阳性反应
细胞核阳性反应
如Ki-67、甲状腺转录因子（TTF-1）、雌激素受体（ER）蛋白、孕激素受体（PR）蛋白等
有些抗体可同时出现细胞质和细胞膜的阳性表达
1>如EMA可呈细胞膜阳性和胞质内弥漫性阳性反应
2>CD15和CD30抗体可同时呈细胞膜阳性和胞质内点状阳性反应等
3.IHC染色技术的应用
IHC应用于
IHC染色已经成为医学基础研究和临床病理诊断中不可或缺的技术手段之一。近年来，IHC技术在组织芯片上的应用使染色效率明显提高，与激光扫描共聚焦显微术的结合使阳性信号的定位识别更加精确，并可实现定性与定量的结合。
各种蛋白质或肽类物质表达水平的检测
细胞属性的判定
淋巴细胞免疫表型分析
激素受体和耐药基因蛋白表达的检测
细胞增殖和凋亡
细胞周期及信号传导的研究等
疑难肿瘤的诊断与鉴别诊断
辅助肿瘤组织来源的判断
内分泌系统肿瘤的功能分类
肿瘤预后的评估，指导临床对靶向治疗药物适用病例的筛选
第三节 电子显微镜技术
一、电镜技术使病理学对疾病的认识从组织、细胞水平深入到超微结构水平
1931年德 Knoll国的和 Ruska研制成功了世界上第一台电子显微镜，通过由电子束和电子透镜组合成的电子光学系统的多极放大后，可以将微小物体放大成像，极大地提高了分辨率。有效放大倍数可达100万倍。透射电子显微镜（ transmission electron microscope TEM）是最早、最广泛应用于医学领域的一种电镜，之后又相继诞生了扫描电镜（ scanning electron microscope，SEM）、超高压电镜等。电子显微镜和光学显微镜的基本原理相同，不同的是光镜的照明源是可见光，而电镜是以电子束为光源。
观察到了细胞膜、细胞器和细胞核的细微结构及其病理变化
产生了超微结构病理学
二、电镜样本处理和超薄切片制作技术比光镜制片更为精细和复杂
但基本过程相似，包括组织取材、固定、脱水、浸透、包埋、切片和染色等
三、以透射电镜样本的制备为例，电镜样本制备主要特点
要求组织新鲜，取材准确，需进行多点取材
双重组织固定，常用的化学固定剂有锇酸、戊二醛等
通常用环氧树脂包埋
半薄切片需先经染色进行组织定位后再行超薄切片
切制超薄切片
重金属盐如醋酸铀或枸橼酸铅等染色
四、应用领域广泛
电子显微镜技术观察样本的细微结构与形态，是病理学诊断和研究的基本技术之一。
胚胎及组织发生学的观察和研究
如通过电镜可观察新生血管芽的发生和形态特点
临床上多种疾病亚细胞结构病变的观察和诊断
如神经肌肉疾病和肾小球疾病的诊断
一些疑难肿瘤（如未分化或多向分化肿瘤）组织来源和细胞属性判断
细胞凋亡的形态学观察
扫描电镜还可对样本进行三维形貌的细微显示和定量
五、局限性
样本制作较复杂、样本取材少、观察范围有限等
因此需要结合组织学观察结果综合分析判断。
第四节 显微切割技术
一、特点及应用
能够从构成复杂的组织中切割下几百个几十个某一特定的同类细胞群甚至单个细胞
再进行后续相关的研究
适用于肿瘤分子生物学研究
肿瘤的克隆性分析
肿瘤发生和演进过程中细胞基因改变的比较研究等
二、组织切片
（1）可以是冷冻切片、石蜡包埋的组织切片或细胞涂片
（2）必须染色，以便进行目标细胞群的定位
染色可以用甲基绿、核固红或苏木素等普通方法，也可采用IHC染色
如要切割霍奇金淋巴瘤组织切片上的R-S细胞时，可用CD15或CD30抗体染色进行靶细胞示踪显微切割的方法有手工操作法和激光捕获显微切割（ laser capture microdissection，LCM）法。
第五节 激光扫描共聚焦显微技术
概述
激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）是将光学显微镜、激光扫描技术和计算机图像处理技术相结合而形成的高技术设备
具有普通光学显微镜无法达到的高分辨率
具有深度识别能力（最大深度一般为200～400μm）及纵向分辨率
能看到较厚生物样本细节
（一）LSCM的主要功能
LSCM的主要功能
细胞、组织光学切片
对组织、细胞及亚细胞结构进行断层扫描
也被称为“细胞CT”或“显微CT”
三维立体空间结构重建
对活细胞的长时间动态观察
细胞内酸碱度及细胞离子的定量测定
细胞间通讯、细胞骨架构成、生物膜结构等的研究
细胞膜流动性测定和光活化技术等
（二）LSCM对样本的要求及其局限性
最好是培养细胞样本，也可以是冷冻组织切片
石蜡包埋组织切片不适用于该技术
主要使用直接或间接免疫荧光染色和荧光原位杂交技术
荧光标记的探针或抗体的质量将直接影响实验结果
第六节 核酸原位杂交技术
概述
（1）定义
原位杂交（ISH）是将组织化学与分子生物学技术相结合以检测和定位核酸的技术
（2）方法
用标记了的已知序列的核苷酸片段作为探针
通过杂交直接在组织切片细胞涂片或培养细胞爬片上检测和定位某一特定靶DNA或 RNA
（3）生物化学基础
DNA变性、复性和碱基互补配对结合
（4）根据所选用的探针和待检测靶序列的不同分类
DNA-DNA杂交
DNA-RNA杂交
RNA-RNA杂交
（一）探针的选择和标记
（1）用于ISH的探针长度一般以50～300bp为宜，于染色体ISH的探针可为1.2～1.5kb
（2）探针标记物分类
1）放射性探针标记物
如放射性同位素3H、35S、32P等
敏感性高，但有半衰期和放射性污染，成本高且耗时，故其使用受到限制
2）非放射性探针标记物
如荧光素、地高辛和生物素等
敏感性不如放射性标记探针，但因其性能稳定操作简便成本低和耗时短等优点应用广泛
（二）ISH的主要程序
（1）实验材料可以是石蜡包埋组织切片、冷冻组织切片、细胞涂片和培养细胞爬片等
（2）程序包括杂交前准备、预处理、杂交、杂交后处理、清洗和杂交体的检测等
（3）操作中应注意问题
对DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交需进行灭活RNA酶处理
当使用双链cDNA探针和（或）待测靶序列是DNA时，需进行变性处理使DNA解链
杂交温度应低于杂交体的解链温度（Tm）25℃左右
ISH远较IHC染色复杂，影响因素颇多
故对照实验必不可少，有组织对照、探针对照、杂交反应体系对照等
（三）荧光原位杂交（FISH）
（1）直接法或间接法进行FISH
直接法FISH
以荧光素直接标记已知DNA探针，所检测靶序列为DNA
间接法FISH
以非荧光标记物标记已知DNA探针，再桥连一个荧光标记抗体
（2）FISH的实验材料可以是间期细胞、分裂中期的染色体，也可以是冷冻或石蜡切片组织
目前已有大量商品化的荧光标记探针，使FISH技术得到越来越广泛的应用。
（四）ISH技术的应用
ISH可应用于
细胞特异性mRNA转录的定位
可用于基因图谱、基因表达的研究
受感染组织中病毒DNA/RNA的检测和定位
如EB病毒mRNA、人乳头瘤病毒（HPV）DNA和巨细胞病毒DNA的检测
癌基因、抑癌基因等在转录水平表达及其变化的检测
基因在染色体上的定位
染色体数量异常和染色体易位等的检测
分裂间期细胞遗传学的研究
如遗传病的产前诊断和某些遗传病基因携带者的确定等
第七节 原位聚合酶链反应技术
概述
将PCR高效扩增与原位杂交的细胞及组织学定位相结合，在冷冻切片或石蜡包埋组织切片、细胞涂片或培养细胞爬片上检测和定位核酸的技术
（一）原位PCR技术方法
（1）直接法原位PCR
（2）间接法原位PCR（应用较广）
主要程序包括组织固定、预处理、原位扩增及扩增产物的原位杂交和检测等
。由于使用ISH技术对扩增产物进行检测，使该方法的特异性较高
（3）原位反转录PCR
（二）原位PCR技术的应用
（1）对低拷贝的内源性基因进行检测和定位
在完整的细胞样本上能检测出单一拷贝的DNA序列
可用于基因突变、基因重排等的观察和研究
（2）外源性基因的检测和定位
如对感染性疾病病原（EB病毒、肝炎病毒、巨细胞病毒等）基因的检测等
（3）对接受了基因治疗的患者体内导入基因的检测等
第八节 流式细胞术
概述
（1）流式细胞术（FCM）是一种可对细胞或亚细胞结构进行快速测量的新型细胞分析技术和精确的分选技术
（2）高度综合了激光技术、细胞化学与免疫细胞化学技术、计算机技术、流体力学、图像分析技术等多领域成果
（3）测量速度快，每秒钟可计测数万个细胞，可进行细胞理化特性的多参数测量
（一）流式细胞仪的工作原理
使悬浮在液体中分散的经荧光标记的细胞或微粒在稳定液流推动装置作用下依次通过样品池
同时由荧光探测器捕获荧光信号并转换为电脉冲信号
经计算机处理形成相应点图、直方图和假三维结构图像进行分析
（二）FCM的应用
具有准确、快速和高分辨力等特性，在医学研究和临床检测中有广泛应用
分析细胞周期，研究细胞增殖动力学
分析细胞增殖与凋亡
定量分析细胞周期并加以分选
测定凋亡细胞比例和数量
分析核酸、蛋白质与细胞周期和凋亡的关系
分析细胞分化、辅助鉴别良恶性肿瘤
利用分化标志物可分析待测细胞的分化状态
通过DNA含量测定和倍体分析可辅助判断肿瘤的良恶性
快速进行细胞分选和细胞收集
根据细胞理化特性、表面标记特性，可分选出目标细胞，研究其生物学特性
细胞多药耐药基因的检测
分析药物在细胞中的含量、分布及作用机制等
第九节 图像采集和分析技术
（一）病理图像采集
数字切片（虚拟切片）
随着网络信息技术的快速发展，远程数字病理诊断已逐渐成为现代医学不可缺少的一个平台
（1）定义
指统通过计算机控制自动显微镜，对观察到的病理切片（或图像）进行全自动聚焦扫描，逐幅自动采集数字化的显微图像，高精度多视野无缝隙自动拼接成一幅完整切片的数字图像
（2）优点（包含了切片全视野信息）
高清晰度
高分辨率
色彩逼真
操作便捷
易于保存
便于检索和教学管理等
（3）应用
显著提高了病理科信息管理水平
极大地方便了病理档案资料的保存、查询、调阅和医疗会诊
病理学教学
数字切片为病理学教学、医师培训及学术交流提供了有效的教学工具，信息量大、操作简便、病变直观，给形态学教学带来革命性的变化
远程会诊
医院或患者通过网络，将数字切片与相关病史上载到诊断平台，专家通过登录平台，远程对患者的病情进行分析和讨论，进一步明确诊断，指导确定治疗方案
病理学科研
数字切片可实现切片后处理，对实验数据信息进行标注，进行病变范围病变程度等相关参数的定量测定，可用于基因表达的分析等。
（二）病理图像分型
肿瘤病理学方面，图像分析技术主要用于
病理图像分析包括定性和定量两个方面，以往受技术所限，常规病理形态学观察基本是定性的，缺乏更为客观精确的定量标准和方法。图像分析技术（ image analysis,IA）弥补了这个不足。 目前，随着计算机技术的发展和形态结构测试手段的进步，一种基于二维切片观察而准确获得组织、细胞和亚细胞三维形态定量特征的方法——体视学（ stereology）已广泛应用于图像分析技术中其优势在于以三维定量数据来表达特征结构信息，在生物学、基础医学和临床医学中得到广泛应用。
（1）细胞核形态参数（如核直径、周长、面积及体积等）的测定
（2）肿瘤组织病理学分级和预后判断
（3）DNA倍体测定和IHC显色反应的半定量
第十节 比较基因组杂交技术
（一）定义
比较基因组杂交（ CGH）技术通过单一的一次杂交可对某一肿瘤全基因组染色体拷贝数量的变化进行检测
（二）基本原理
利用不同荧光染料分别标记肿瘤细胞或组织DNA和正常细胞或组织DNA
并与正常人的分裂中期染色体进行共杂交
通过检测染色体上显示的肿瘤组织与正常对照组织不同的荧光强度
反映肿瘤基因组DNA表达状况的变化
再借助图像分析技术对染色体拷贝数量的变化进行定量研究
（三）CGH已广泛应用于肿瘤发病分子机制等方面的研究
(1)技术优点
实验所需样本DNA量较少
做单一的一次杂交即可检查肿瘤全基因组的染色体拷贝数量变化
该方法适用于外周血、培养细胞、新鲜组织样本、石蜡包埋组织样本的研究
(2)局限性
一是用CGH所能检测到最小的DNA扩增或缺失是3～5Mb，对于低水平的DNA扩增和小片段缺失可能漏检
二是当染色体拷贝数量无变化时，CGH检测不出平行染色体的易位
第十一节 生物芯片技术
生物芯片技术（ biochip technique）是近年来发展起来的生物医学高新技术，包括基因芯片、蛋白质芯片和组织芯片等。
（一）基因芯片
概述
又称DNA芯片，是指将大量靶基因或寡核苷酸片段有序高密度地排列在硅片、玻璃片、尼龙膜等载体上，形成DNA微点阵
1.基因芯片的分类和工作原理
（1）按功能用途分类为
1）表达谱基因芯片
主要用于基因功能的研究
2）诊断芯片
3）检测芯片
用于遗传病、代谢性疾病和某些肿瘤的诊断、病原微生物的检测等
（2）基本原理
用不同荧光染料通过反转录反应将不同组织mRNA分别标记制成探针
将探针混合后与芯片上的DNA片段进行杂交、洗涤
用特有荧光波长扫描芯片，得到基因在不同组织中的表达谱图片
通过计算机分析基因在不同组织表达差异
2.基因芯片的应用
（1）应用
1）生命科学研究的各个领域
基因表达谱分析
肿瘤基因分型
基因突变检测
新基因寻找
遗传作图等基础研究
2）临床上可用于抗生素和肿瘤药物的筛选和疾病的诊断
（2）优点
大规模、通量地对成千上万个基因同时进行研究，解决了传统的核酸印迹杂交技术自动化程度低、操作复杂、检测效率低等问题
（3）实验材料要求
从新鲜组织或培养细胞中提取的mRNA
（二）蛋白质芯片
（1）基本原理
蛋白质芯片又称蛋白质微阵列，是在一个载体上高密度地点布不同种类蛋白质
用荧光标记的已知抗体或配体和待测样本中的抗体或配体一起同芯片上的蛋白质竞争结合
利用荧光扫描仪测定芯片上各点阵的荧光强度
计算机分析出待测样本结果
（2）优点及应用
高效率、低成本、全自动化检测等特点
1）尤其适合于蛋白表达的大规模、多种类筛查
2）还可用种感染因素的筛查和肿瘤的诊断
（三）组织芯片
（1）定义
又称组织微阵列，是将数十个至数百个小的组织片整齐地排列在某一载体上（通常是载玻片）而成的微缩组织切片组织芯片的制作流程主要包括组织筛选和定位阵列蜡块的制作和切片等步骤
（2）优点
1）体积小、信息含量大，并可根据不同的需求进行组合
2）高效、快速地进行各种组织的原位观察和研究（如形态学、免疫组织化学、原位杂交等）
3）有较好的内对照及实验条件可比性
（3）应用
1）科研工作中可单独应用或与基因芯片联合应用，用于基因及其蛋白表达产物的分析和基因功能的研究
2）用于基因探针的筛选、抗体等生物制剂的鉴定
3）作为组织学和病理学实习教材和外科病理学微缩图谱等
第十二节 第二代测序技术
（一）第二代DNA测序技术（NGS）优点
大规模、高通量、短时间、低成本等特点
一次能对高达几百万条的DNA分子进行测序，使得对全基因组或全转录组测序变得方便易行
（二）NGS技术应用
乳腺癌基因筛查技术已投入临床使用，通过检测乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2，预测乳腺癌的发生几率用于筛查乳腺癌的高危人群。
（1）疾病的诊断
（2）发病机制的研究
（3）为临床提供突变特征、药物靶点的选择等综合信息
（4）辅助肿瘤个体化治疗的实施
第十三节 生物信息学技术
（一）定义
生物信息学是一门新兴的交叉学科，涉及生物学数学、物理学、计算机科学和信息科学等多个领域
生物信息学以计算机、网络为工具，以数据库为载体，建立各种计算模型，对大量的生物学数据进行收集、存储、集成、查询、处理及分析，揭示蕴含在数据中的丰富内涵，从而掌握细胞、器官和个体的发生、发育、病变等复杂生命现象的规律。
（二）主要任务
①生物信息的收集、存储、管理与提供
建立生物信息数据库是生物信息学的重要内容，提供数据查询、搜索、筛选和序列比对，并为信息分析和数据挖掘打下基础。
②生物学数据的处理和分析
通过数据分析，认识数据的本质以及数据之间的关系，并在此基础上了解基因与疾病的关系，为疾病的诊治、发病机制的研究、新药作用靶点的确定、药物分子的设计等奠定基础。
③生物学数据的有效利用
开发研制分析数据的新工具，为生物信息学的实际应用服务。如与大规模基因表达谱分析相关的算法和软件研究，基因表达调控网络的研究等。生物分子信息处理流程见图18-12。
第十四节 人工智能技术
（一）定义
人工智能（AI）是研究解释和模拟人类智能、智能行为及其规律的一门学科
设计可展现某些近似于人类智能行为的计算系统，是计算机科学的一个重要分支和计算机应用的广阔新领域
（二）AI应用
随着数字病理切片在病理诊断中的应用，大量定量分析算法应运而生，包括传统机器学习算法和深度学习算法。近年来，高质量数字病理切片的大量积累为病理切片的分析提供了大数据背景，深度学习等人工智能算法对大数据样本的分析能力强在病理切片分析中表现出巨大潜力，大大推进了病理图像自动诊断的发展。病理医师根据计算机辅助算法的分析结果可以对疾病作出进一步诊断。如宫颈细胞学的计算机辅助诊断，皮肤癌、前列腺癌的诊断，其效果也近乎于病理医师水平。
（1）病理形态数据的分析
（2）整合免疫组织化学、分子检测数据和临床信息
得出综合的最后病理诊断报告
为患者提供预后信息和精准药物治疗指导