病毒学4.1 病毒研究的实验系统

病毒学相关思维导图，介绍病毒研究的实验系统（主要内容为细胞），病毒的存在形式：细胞外的具有感染性的颗粒形式、细胞内的具有繁殖性的基因形式。

病毒学4.1 病毒复制研究的实验系统

• 1. 用于病毒复制研究的实验系统
  • 病毒的存在形式
    • 细胞外的具有感染性的颗粒形式
    • 细胞内的具有繁殖性的基因形式
  • 病毒的培养系统
    • 噬菌体培养——细菌培养系统
    • 动物病毒培养——动物细胞培养系统
    • 植物病毒培养——植物原生质体培养系统
    • 生物学本质均为细胞
  • 细胞是病毒的装配工厂（而非坟墓）
    • 细胞膜
      • 吸附、侵入、膜融合、囊膜的获得、释放
    • 细胞浆/细胞质
      • 脱壳、生物合成、装配、形成包涵体
        • 补充：包涵体对于病毒的发现、诊断等具有价值
    • 细胞器
      • 生物合成、囊膜的获得
    • 细胞核
      • 脱壳、生物合成、装配、囊膜的获得、形成包涵体
• 2. 组织细胞培养
  • 细胞
    • 原代细胞
      • 应用胰酶等分散剂将动物组织消化成单个细胞悬液
      • 适当洗涤以后，加入营养液，通常即可使其贴附于细胞培养瓶壁上，并生长增殖
    • 继代细胞
      • 将原代细胞从培养瓶壁上消化下来再作培养
      • 传递几代后全部死亡
      • 端粒限制了正常细胞不可能永远传代，而传代细胞由于基因突变，可以无限增殖和培养
    • 传代细胞
      • 由于遗传突变或者在理化因子和致瘤病毒的作用下，组织培养细胞中有时出现恶性变细胞，也就是癌变细胞
      • 这种癌变细胞具有很高的增殖势能，几乎可以无限地传代
      • 优点
        • 无限传代
        • 生长旺盛，繁殖快速，对营养条件不苛刻
        • 很多细胞系对病毒很敏感，可满足特定实验需求
        • 某些传代细胞系能在悬浮培养条件下培养，适合病毒抗原的大量生产
      • 缺点
        • 传代过程中容易遭到支原体和病毒的污染
  • 细胞分散剂
    • 胰酶(trypsin)
      • 来自牛或猪的胰脏，作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，使细胞分离
      • 常用的浓度是0.25-0.125%，温度为37℃或室温， pH7.4左右
      • Ca2+、Mg2+和血清会降低其活力，所以细胞分散后，可用血清培养基终止其消化作用
    • EDTA·2Na(乙二胺四乙酸二钠)
      • 一种螯合剂，夺取组织中的Ca2+、Mg2+使其丧失完整性，从而使细胞分离
      • 通常使用浓度是0.02%，与0.25%胰酶混合使用可提高消化效率
      • 只用于传代细胞，不适用于原代细胞的消化（对细胞损伤较大）
      • EDTA作用不受血清抑制（无法用血清中和），消化后需彻底去除，否则影响细胞生长
    • 胶原酶(collagenase)
      • 使细胞间质的脯氨酸多肽水解，从而使细胞分散
  • 细胞的保存
    • 细胞培养物的常温短期保存
      • 实验室中细胞短期保存
        • 将已长成单层的细胞换液后置室温或20-22℃下避光保存，可达15天以上
        • 将细胞培养温度由37℃降至32℃甚至30℃，可隔15-30天传代一次
      • 长途运送细胞培养物的保存
        • 取刚刚长成单层的细胞培养物，弃去营养液，加入维持液至满瓶
          • 勿使培养瓶内存留空气，随后用橡皮塞塞紧塞瓶口，并作适当的包扎
        • 运输途中的温度应保持在15-25℃左右，到达目的地后，置37℃培养1天，再传代
    • 细胞培养物的长期保存
      • 将刚长满单层的细胞，按细胞传代方法消化吹散后，装入离心管中，3000r/min 5-10min，用适量的含有20%犊牛血清、10%二甲亚砜(DMSO)的DMEM悬浮，分装于细胞冻存管中
        • 后续的不同操作
          • 置4℃ 2h，-20℃ 2h，-70℃过夜，然后置于液氮中长期保存
          • 在液氮气相中过夜，然后置于液氮中长期保存
          • 置于液氮气相中，按5min/cm的速度逐渐往下降直至液氮中长期保存
  • 细胞的复苏
    • 将冻存于液氮中的细胞取出，迅速置于42℃-50℃水浴中，并不停地摇动，使其快速解冻
      • 离心去掉冻存液，用生长液悬浮，再置于细胞培养瓶中进行培养
      • 或者不离心直接转移到细胞培养瓶中，等其贴壁几小时后，再换入新的生长液继续培养
  • 细胞冻存与复苏的基本原则
    • 缓慢降温，快速解冻
    • 均为防止冰晶的形成
  • 补充：病毒的保存
    • 短期保存
      • 可直接悬浮于50%甘油盐水中，再置-30℃冰箱中保存
    • 长期保存
      • 快速低温冻存
        • 病毒悬液，加入灭活动物血清或其他蛋白质保护剂和 5%- 10%DMSO，迅速置- 70℃或- 196℃保存
        • 含病毒的组织材料，可直接低温冰冻保存；或先浸入 50%甘油生理盐水，再低温保存
      • 冷冻干燥
        • 加入保护剂，在真空条件下使冰冻的病毒悬液脱水
        • 冻干毒种时，用脱脂牛乳、灭活的正常动物血清、饱和蔗糖溶液等保护剂将病毒液作2-5倍的稀释，分装安瓿瓶，每支0.2-0.5 mL，立即放入事先预冷的-30℃至-40℃酒精中冻结1-2 h，随后置于冻干机内，冷冻干燥，然后抽真空并封瓶