导图社区 病毒学4.1 病毒研究的实验系统
病毒学相关思维导图,介绍病毒研究的实验系统(主要内容为细胞),病毒的存在形式:细胞外的具有感染性的颗粒形式、细胞内的具有繁殖性的基因形式。
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病毒学4.1 病毒复制研究的实验系统
1. 用于病毒复制研究的实验系统
病毒的存在形式
细胞外的具有感染性的颗粒形式
细胞内的具有繁殖性的基因形式
病毒的培养系统
噬菌体培养——细菌培养系统
动物病毒培养——动物细胞培养系统
植物病毒培养——植物原生质体培养系统
生物学本质均为细胞
细胞是病毒的装配工厂(而非坟墓)
细胞膜
吸附、侵入、膜融合、囊膜的获得、释放
细胞浆/细胞质
脱壳、生物合成、装配、形成包涵体
补充:包涵体对于病毒的发现、诊断等具有价值
细胞器
生物合成、囊膜的获得
细胞核
脱壳、生物合成、装配、囊膜的获得、形成包涵体
2. 组织细胞培养
细胞
原代细胞
应用胰酶等分散剂将动物组织消化成单个细胞悬液
适当洗涤以后,加入营养液,通常即可使其贴附于细胞培养瓶壁上,并生长增殖
继代细胞
将原代细胞从培养瓶壁上消化下来再作培养
传递几代后全部死亡
端粒限制了正常细胞不可能永远传代,而传代细胞由于基因突变,可以无限增殖和培养
传代细胞
由于遗传突变或者在理化因子和致瘤病毒的作用下,组织培养细胞中有时出现恶性变细胞,也就是癌变细胞
这种癌变细胞具有很高的增殖势能,几乎可以无限地传代
优点
无限传代
生长旺盛,繁殖快速,对营养条件不苛刻
很多细胞系对病毒很敏感,可满足特定实验需求
某些传代细胞系能在悬浮培养条件下培养,适合病毒抗原的大量生产
缺点
传代过程中容易遭到支原体和病毒的污染
细胞分散剂
胰酶(trypsin)
来自牛或猪的胰脏,作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽键,除去细胞间粘蛋白及糖蛋白,使细胞分离
常用的浓度是0.25-0.125%,温度为37℃或室温, pH7.4左右
Ca2+、Mg2+和血清会降低其活力,所以细胞分散后,可用血清培养基终止其消化作用
EDTA·2Na(乙二胺四乙酸二钠)
一种螯合剂,夺取组织中的Ca2+、Mg2+使其丧失完整性,从而使细胞分离
通常使用浓度是0.02%,与0.25%胰酶混合使用可提高消化效率
只用于传代细胞,不适用于原代细胞的消化(对细胞损伤较大)
EDTA作用不受血清抑制(无法用血清中和),消化后需彻底去除,否则影响细胞生长
胶原酶(collagenase)
使细胞间质的脯氨酸多肽水解,从而使细胞分散
细胞的保存
细胞培养物的常温短期保存
实验室中细胞短期保存
将已长成单层的细胞换液后置室温或20-22℃下避光保存,可达15天以上
将细胞培养温度由37℃降至32℃甚至30℃,可隔15-30天传代一次
长途运送细胞培养物的保存
取刚刚长成单层的细胞培养物,弃去营养液,加入维持液至满瓶
勿使培养瓶内存留空气,随后用橡皮塞塞紧塞瓶口,并作适当的包扎
运输途中的温度应保持在15-25℃左右,到达目的地后,置37℃培养1天,再传代
细胞培养物的长期保存
将刚长满单层的细胞,按细胞传代方法消化吹散后,装入离心管中,3000r/min 5-10min,用适量的含有20%犊牛血清、10%二甲亚砜(DMSO)的DMEM悬浮,分装于细胞冻存管中
后续的不同操作
置4℃ 2h,-20℃ 2h,-70℃过夜,然后置于液氮中长期保存
在液氮气相中过夜,然后置于液氮中长期保存
置于液氮气相中,按5min/cm的速度逐渐往下降直至液氮中长期保存
细胞的复苏
将冻存于液氮中的细胞取出,迅速置于42℃-50℃水浴中,并不停地摇动,使其快速解冻
离心去掉冻存液,用生长液悬浮,再置于细胞培养瓶中进行培养
或者不离心直接转移到细胞培养瓶中,等其贴壁几小时后,再换入新的生长液继续培养
细胞冻存与复苏的基本原则
缓慢降温,快速解冻
均为防止冰晶的形成
补充:病毒的保存
短期保存
可直接悬浮于50%甘油盐水中,再置-30℃冰箱中保存
长期保存
快速低温冻存
病毒悬液,加入灭活动物血清或其他蛋白质保护剂和 5%- 10%DMSO,迅速置- 70℃或- 196℃保存
含病毒的组织材料,可直接低温冰冻保存;或先浸入 50%甘油生理盐水,再低温保存
冷冻干燥
加入保护剂,在真空条件下使冰冻的病毒悬液脱水
冻干毒种时,用脱脂牛乳、灭活的正常动物血清、饱和蔗糖溶液等保护剂将病毒液作2-5倍的稀释,分装安瓿瓶,每支0.2-0.5 mL,立即放入事先预冷的-30℃至-40℃酒精中冻结1-2 h,随后置于冻干机内,冷冻干燥,然后抽真空并封瓶