蛋白质的化学

生物化学思维导图，蛋白质的化学组成中的元素组成主要有CHON,还含有SPI,Fe，Cu，Mn，Zn，平均含氮量16%，一起来了解蛋白质吧。

蛋白质的化学

• 五、蛋白质的性质
  • 1、蛋白质分子大小与形状
    • 大小
      • 一万道尔顿区分多肽和蛋白质
        • 胰岛素5437道尔顿，蛋白质
    • 形状
      • 不对称常数决定
        • 球形、椭圆形、纤维状
  • 2、蛋白质变性与复性
    • 变性的本质：破坏次级键，不涉及蛋白质一级结构/肽键断裂 造成变性的因素 物理：加热、X射线、紫外线 、超声波、剧烈搅拌等。 化学：强酸、强碱、尿素、乙醇、重金属离子、三氯醋酸等。 应用举例： 1、临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。 2、防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件 复性：若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性(renaturation) 。 但是许多蛋白质变性后，空间结构严重被破坏，不能复原，这样的蛋白质变性称为不可逆变性
  • 3、蛋白质两性解离与等电点
  • 4、蛋白质的胶体性质
    • 蛋白质分子量在1万-100万间，分子直径在1-100nm，为胶粒范围。 影响蛋白质胶体稳定的因素： 1、颗粒表面电荷 2、水化膜 失去水化膜后，蛋白质颗粒在等电点处最不稳定，容易沉淀析出 
  • 5、蛋白质的沉淀反应
    • 蛋白质沉淀： 在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链间会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。 变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。 蛋白质的凝固作用(protein coagulation) 蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。（一定变性） 
  • 6、蛋白质的颜色反应
    • 茚三酮
      • 蛋白质水解后氨基酸
    • 双缩脲
      • 蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应
      • 检测蛋白质水解程度
    • 酚试剂显色反应（Lowry test）
      • 蛋白质分子中的色氨酸与酪氨酸残基将酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸盐还原生成蓝色化合物（钼蓝）
    • 染料结合法（Bradford法）
      • 蛋白质与考马斯亮蓝G-250反应→亮蓝色化合物，在595nm处有最大吸收。在一定蛋白质浓度范围内，吸收强度与蛋白质含量之间线性关系
  • 7、蛋白质的免疫学性质
    • 抗原、抗体、单抗多抗特点、免疫性质应用
• 六、蛋白质分离纯化与结构分析
  • 蛋白质提取
    • 材料预处理、细胞破碎、抽提
      • 抽提：把生物物质从生物组织中以溶解状态释放出来
  • 蛋白质分离纯化
    • 根据溶解度不同分离纯化
      • 等电点沉淀法
      • 盐析法
      • 有机溶剂沉淀法
    • 根据分子大小不同分离纯化
      • 透析
      • 超滤
      • 超速离心
        • 超速离心法(ultracentrifugation)既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。 蛋白质在离心场中的行为用沉降系数(sedimentation coefficient, S)表示,沉降系数与蛋白质的密度和形状相关
      • 凝胶过滤层析，密度梯度离心等
    • 根据分子大小和电离性质等分离纯化
      • 电泳
      • 离子交换、凝胶、亲和层析；高效液相色谱（HPLC）
  • 蛋白质纯度/含量鉴定
    • 分离纯化的方法（如层析、电泳、免疫化学等都可以用于蛋白质的定性、定量）
    • 层析法
    • 电泳法
    • 免疫化学法
    • 紫外吸收280nm（色酪）
    • 凯氏定氮法
      • 蛋白质经硫酸消化，蒸馏出NH3，用定量的硼酸吸收，再用标准浓度的酸滴定，然后根据氮含量平均为16%进行计算。
    • 福林-酚试剂法（Lowry法）
      • 在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的 酪氨酸和色氨酸残基还原，产生深蓝色（钼蓝和钨蓝的混合物）。在一定的条件下,蓝色深度与蛋白的量成正比。
    • 双缩脲法
    • BCA比色法
      • 碱性条件下，蛋白质将Cu2+还原为Cu+再与BCA试剂（4,4’-二羧酸- 2,2’-二喹啉钠）生成紫色复合物。
    • Brandford蛋白分析法
      • 考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水区相结合，考马斯亮蓝G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置，由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色
  • 蛋白质结构鉴定技术
    • 
    • 圆二色光谱
    • X射线衍射法(X-ray diffraction)和核磁共振技术(nuclear magnetic resonance, NMR)
      • 研究蛋白质三维空间结构最准确方法
• 七、蛋白质类药物研究应用
  • 激素类
  • 抗体类
  • 细胞因子类
• 四、蛋白质的结构与功能
  • 一级结构与功能关系
    • 一级结构是空间构象的基础 一级结构不同，生物学功能各异；一级结构“关键部分”相同，其功能也相同；“关键部分”变化，生物活性也改变。 分子病：由遗传突变引起的、在分子水平上仅存在微观差异而导致的疾病，称之为“分子病” 构型(Configuration)：指分子中各个原子或基团特有的固定的空间排列。立体异构体中取代基团或原子因受某种因素的限制，在空间取不同位置就形成的不同立体结构。构型的改变涉及共价键的断裂，也往往使分子的化学活性发生变化。 构象(Conformation)：分子中不同碳原子上的各原子或基团的空间排列关系，即不要改变共价键就可以使分子的立体结构发生改变，此立体结构就称构象。
  • 蛋白质构象与功能关系
    • 特定的空间构象是表现其生物学功能所必需的
    • 前体活化
    • 变构现象
      • 定义：一些蛋白质由于某些因素影响，一级结构不变而空间构象改变，导致生物学功能的改变叫变构效应 正协同效应,负协同效应,详见血红蛋白
    • 构象改变与疾病关系
      • 疯牛病： 正常的朊病毒蛋白（PrP）富含α-螺旋，称为PrPc。 PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为β-折叠的PrPsc，从而致病。
  • 蛋白质结构与生物进化
• 三、蛋白质的分子结构
  • 一级结构（空间构象的基础）
  • 高级结构（空间构象）
    • 二级结构
      • 仅由氢键决定
      • 基序
        • 模体（motif），又名膜序，基序，区别于三级中的结构域（domain），它指相邻的二级结构彼此相互作用，形成有规则的、空间上能辨认的，具有特定功能的二级结构组合体，可直接作为三级结构中结构域的组成单位。是超二级结构（介于二级和domain之间），蛋白质发挥特定功能的基础。 结构域承担特定生物学功能，模体不一定承担生物学功能
      • α-helix
      • β-（pleated）sheet
      • β-turn
        • β由四个连续氨基酸残基组成，第二个通常为脯氨酸
      • Ω-loop，random coil
        • Ω环存在于球状蛋白质中，蛋白质分子表面
    • 三级结构
      • 蛋白质的三级结构(tertiary structure)，是指整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。即肽链中所有原子（二级结构是氨基酸主链，不包括R基）在三维空间的排布位置。 主要的化学键：疏水键、离子键、氢键和 Van der Waals力等
    • 四级结构
      • 有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链,每一条多肽链都有完整的三级结构,称为蛋白质的亚基(subunit) 蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用,称为蛋白质的四级结构(quaternary structure) 。 亚基之间的结合力主要是疏水作用，其次是氢键和离子键。
      • 主要次级键——疏水键
  • 次级键（副键）的类型
    • 氢键
      • 键能最小，数量最多
        • 多肽骨架羰基氧与亚氨基氢——二级结构
        • 侧链间/主链骨架间氢键——三、四级结构
    • 疏水键
      • 非极性基团为避开水相而聚集形成
      • 三、四级结构主要次级键
    • 离子键
      • 盐键，蛋白质正电荷/负电荷间相互吸引而成
    • 配位键
      • 参与维持三、四级结构
    • 范德华力
• 二、蛋白质的化学组成
  • 1、元素组成
    • 主CHON,辅SPI,Fe，Cu，Mn，Zn
      • 平均含氮量16%
  • 2、基本组成单位
    • 氨基酸的结构
      • 组成天然蛋白质的氨基酸均为L型-α-氨基酸 （甘氨酸无手性）（脯氨酸为α-亚氨基酸）
        • 
    • 氨基酸的分类
      • 非极性R基、极性R基、带负电、带正电
        •  起始：AUG-甲硫氨酸 终止：UAA;UAG;UGA
        • 第21种，硒代半胱氨酸 第22种，吡咯赖氨酸
    • 氨基酸的性质
      • 一般物理性质
        • 无色高熔点晶体，旋光性（与DL构型无直接关系）
      • 化学性质
        • 1.等电点
          • 氨基酸解离成兼性离子的pH值
            • 两个可解离基团
              • pI=（pK2+pK1）/2
                • pI<pH带负电，反之带正电
            • 三个可解离基团
              • pI=（pK2+pK1+2pKR）/4
        • 2.紫外吸收
          • 含共轭双键的氨基酸（Trp，Tyr）在280nm处有最大吸收峰，蛋白质定量分析
            • 测光吸收值，粗测，不准确
        • 3.茚三酮反应
          • 氨基酸与茚三酮水合物共热生成蓝紫色物质，最大吸收峰570nm，定量分析
            • 仅能定量氨基酸
    • 氨基酸的功能
      • 1、生物活性物质前体
      • 2.神经递质
      • 3.氧化分解产ATP
      • 4.糖异生原料
    • 氨基酸的分离与分析
• 一、概述
  • 一、蛋白质的含量与分布
    • 人干重45%（最多），某些组织80%
  • 二、蛋白质的主要生物学作用
    • 见P66表43
    • 生物催化
    • 代谢调节
    • 免疫保护
    • 物质转运和存储
    • 运动与支持
    • 控制生长分化
    • 构成生物膜
  • 三、蛋白质的分类
    • 按化学组成分类
      • 单纯蛋白质，结合蛋白质（非蛋白辅助因子/辅基）
    • 按溶解度分类
      • 可溶性、醇溶性、不溶性
    • 按形状分类
      • 纤维状、球状（长短轴比是否>10）
    • 按功能分类
      • 活性（大多为球状蛋白，都有识别功能）
        • 包括生命活动一切活性蛋白质及其前体
      • 非活性（保护、支持作用，纤维状、不溶性蛋白）
• 蛋白质和多肽合成（书第五节）
  • 化学合成
    • 氨基酸基团保护
      • 氨基
        • ①苄氧羰酰氯(Cbz-Cl)保护，后用H2/Pd或钠-液氨法除去。 ②叔丁羰酰氯(BOC-Cl)保护，后用稀盐酸除去。
      • 羧基
        • 无水乙醇成酯，碱水解清除
      • 侧链活性基团
    • 多肽液相合成
      • 反应物在完全溶解状态下作均相缩合。合成肽的质量较高，但耗时、繁琐、产率较低。
    • 多肽固相合成
      • 反应产物共价连接于树脂，操作简单，易于规范化和机械化，被广泛采用
  • 生物合成
    • 基因工程
    • 细胞工程
    • 酶工程