特异性抗体制备技术

医学免疫学检验技术 抗体制备，整理了 免疫血清的制备、单克隆抗体制备（McAb）、基因工程抗体制备、抗原抗体反应（物理反应）、抗原抗体结合的特点、影响抗原抗体反应的因素的内容，一起来看吧！

特异性抗体制备技术

• 免疫血清的制备
  • 免疫血清
    • 从经特定免疫原刺激的机体采集、含有特异性抗体的血清（抗血清）
    • 由多种B细胞克隆产生，能与多种表位结合的混合抗体，称为多克隆抗体
  • 获得免疫血清的途径
    • 动物免疫血清
    • 感染康复者血清
    • 疫苗接种者血清
• 单克隆抗体制备（McAb）
  • 概念
    • 由B杂交瘤细胞单克隆产生，只与一种表位结合的完全均一的抗体
  • 制备技术
    • B杂交瘤细胞技术:细胞工程技术→动物免疫接种→细胞制备→细胞杂交→细胞培养→细胞筛选→克隆化等技术
  • 制备基本原理
    • B杂交瘤细胞产生的原理
      • 抗原致敏B细胞:能分泌合成抗体，不能在体外培养
      • 骨髓瘤细胞:不能分泌合成抗体，能在体外长期培养
      • 融合→杂交瘤细胞
        • 制备针对一种表位的McAb
        • 能合成分泌抗体
        • 能在体外长期培养
    • B杂交瘤细胞筛选的原理
    • 产生特异性抗体的B杂交瘤细胞筛选
      • 取有B杂交瘤细胞生长的培养孔内培养液，利用抗原抗体特异性结合的原理检测是否有特异性Ab （贴壁生长）
    • 产生特异性抗体的B杂交瘤细胞克隆化
      • 单核细胞培养以获得单克隆细胞的过程 （方法:有限稀释法、显微镜操作、细胞分选仪）
• 基因工程抗体制备
  • 概念
    • 用基因/蛋白质工程技术对编码Ab基因进行改造（切割、拼接、修饰和重新组装）后，受体细胞所表达的新型Ab分
  • 从三个方面改造McAb分子
    • 鼠源mAb人源化:降低mAb对人的异物性 人-鼠嵌合Ab和人源化Ab
    • 小分子mAb:增强mAb渗透力，有利于mAb深入组织内（Fab Fv VH CDR等）
    • 改进抗体功能:双特异性抗体和双功能抗体等
• 抗原抗体反应（物理反应）
  • 反应原理
    • 抗原抗体结合力（非共价键—分子间作用力）
      • 静电引力 氢键:最具特异性 范德华引力:最小 疏水基团:最大
        • ①力很弱 ②这些作用力发挥最大限度作用的关键是抗原抗体空间构型的互补 ③受抗原抗体所处环境因素的影响（温度、酸碱度、离子强度）——在生理PH值和离子强度条件下，这些结合力通常最大
    • 抗原抗体结合的亲和性与亲合力
      • 亲和性:抗体分子上一个抗原结合位点与抗原上一个相应表位之间相适应而结合的强度
        • 相适应 ①空间构型相适应（相似、互补） ②原子基团相适应（电荷、亲水疏水等相适应）
      • 亲和性取决于Ab抗原结合部位与Ab表位间的空间构型互补程度及氨基酸序列
      • 亲和性是抗原抗体间固有的结合力
      • 亲合力是一个Ab分子上多个Ag结合位点与一个Ag上多个表位间结合强度的总和
        • 亲合力与亲和性、抗原结合价、抗体结合价空间位阻有关
    • 液相中抗原抗体结合反应
      • 抗原抗体结合后由亲水胶体变成了疏水胶体（稳定性降低）→原因
        • 适当浓度电解质是净电荷进一步中和，水化膜破坏，形成抗原抗体复合物:可见
        • 净电荷减少（中和了）
        • 水化膜变薄（极性基团）
    • 固相表面抗原抗体结合反应
      • 先将抗原抗体结合在固体上（固相抗原 固相抗体）
      • 微粒
      • 微孔
      • 小珠
      • 微孔滤膜
      • ①反应速度 液相＞固相（固相只有一个可以动） a.加快液相分子的扩散（振荡、离心、微波或超声） b.增加固相单位体积的反应表面积<速度↑> ②反应效率 液相＞微粒＞微球＞微孔 ③解离速率 液相＞固相 ④有效利用率 液相＞固相（固相抗原抗体的朝向和重叠等问题）
• 抗原抗体结合的特点
  • 特异性（抗原抗体结合反应的专一性）
    • 结构基础
      • 抗原表位与抗体CDRs间结构互补性（空间结构和原子基团相适应性）
      • 能区分光学构象、立体构象、电荷及蛋白质氨基酸序列的微小差别
      • 许多抗体只结合具有三级结构的天然抗原或抗原片段
      • 是用已知Ag/Ab检测相应Ab/Ag的理论基础
      • 病原体基因突变、标本/试剂Ag保存不当而降解或变性→抗原表位改变
      • 天然大分子Ag具有多个表位，若具有两个相同的表位，发生交叉反应→假阳性
  • 可逆性
    • 抗原抗体反应为可逆反应
      • 原因 抗原与抗体结合是抗原抗体表面化学基团之间的非共价键 结合:很弱分子间作用力
      • 抗原抗体复合物解离度取决于
        • 抗原与抗体之间的亲合力:亲合力越高，不易解离
        • 环境因素:温度、PH、离子强度
        • 一定条件下（去污剂、高/低Ph等）可以使抗原抗体复合物解离<常用的是低Ph或高离子强度解离Ag-Ab复合物>
  • 比例性
    • 多价抗原与相应抗体发生可见反应需遵循一定的量比关系（量的比例要合适并且浓度要合适）<单价抗原与抗体结合后是不可见的>
      • 前带——抗体过量（抗体过剩、抗原抗体复合物小，出现可见无慢、量少）
      • （一个范围）等价带——抗原抗体比例合适<最适比> 网格状复合体（免疫复合物大，出现快，量多）
      • 后带——抗原过量
    • 效价（滴度）:抗原抗体反应时，出现可见现象的抗原或抗体的最高稀释度→系列倍比梯度稀释法（被稀释溶液与稀释液等体积混合，1:2，1:4，1:8）先向管中加稀释液，再向第一个管中加原液
      • 可见现象:肉眼能够看到的➕仪器能够检测到的 稀释度:用体积比表示（原液的体积/原液➕稀释液的体积）
  • 阶段性
    • 第一阶段:特异性结合阶段→抗体CDRs组合与抗原表位结构互补性的非共价键结合
      • 特点:反应快，不可见
      • 决定性因素:特异性
      • 影响因素:亲和性↑→结合速度↑
    • 第二阶段:反应可见阶段→小分子IC之间靠正电荷吸引、交联和聚集形成较大的IC
      • 特点:反应慢，出现凝聚物、沉淀物或细胞裂解等可见现象
      • 影响因素:是否出现可见现象及速度
        • 反应物本身
        • 环境因素
• 影响抗原抗体反应的因素
  • 反应物自身因素
    • 抗原
      • 理化性状，表位的种类和数目，活性，效价，来源等
        • 来源:天然抗原、合成多肽、重组多肽 与天然抗原比较，后两者存在表位缺失或不同→相应抗体漏检 纯度影响特异性→抗体检测假阳性
    • 抗体
      • 特异性，亲和性，活性，效价，来源等
        • 来源: ①来源于小动物<兔子>（R型抗体）:亲和力高，等价带宽→免疫学检测，治疗，预防 ②来源于马等大动物（H型抗体）:亲和力低，等价带窄→免疫学治疗和预防 ③多克隆抗体(PcAb):与多种表位结合→不易漏检相应抗原，易发生检查反应<假阳性>，主要用于凝集反应和沉淀反应 ④单克隆抗体（McAb):只与一种表位结合→不易出现交叉反应，可因其结合的表位确实或改变而导致抗原漏检<假阴性>，适用于标记免疫技术 ⑤混合McAb:具有③④的优点
        • 亲和性↑灵敏度上检出限↓
  • 基质（标本内除了待测物以外的其他物质）因素
    • 干扰物质:干扰抗原抗体反应但与待测物本身无关的物质→内源性干扰物（无关蛋白，盐，补体，异嗜性抗体（能够与多种动物免疫球蛋白结合的抗体），自身抗体抗Ig的抗体<类风湿因子，是抗抗体>），溶菌酶，交叉反应物，药物等
      • 消除方法
        • 优化改进实验:不要Fc段，稀释减少标本用量，改进实验原理
        • 加阻断剂:
    • 影响信号测定的因素
      • 混浊
  • 环境因素
    • 酸碱度:生理PH值附近（6.5-8.5） Ph主要影响抗原抗体的结合力和活性（ph超出范围 不易形成抗原抗体复合物） ph＜3或＞10.5抗原抗体复合物解离 Ph过低或过高，失去活性 接近或等于等电点，析出
    • 电解质:生理盐水或缓冲液
      • 抗原抗体反应液中必须有电解质
      • 反应液中的电解质浓度要适当:浓度低了，达不到目的；高了，解离或发生盐析
    • 温度
      • 影响反应速率
      • 影响可逆反应的平衡，升高温度向左移动，检测下限↑
      • 过高，失活变性 过低，结合更牢固，但反应慢
    • 振荡或搅拌