第十章 发育毒性与致畸作用

发育毒理学 (developmental toxicology)研究出生前暴露于环境有害因子导致的异常发育结局及有关的作用机制、发病原理、影响因素和毒物动力学等。

第十章 发育毒性与致畸作用

• 1.概述
  • 发育毒理学 (developmental toxicology)研究出生前暴露于环境有害因子导致的异常发育结局及有关的作用机制、发病原理、影响因素和毒物动力学等。
• 2.发育毒性与致畸性
  • 2.1基本概念
    • 畸形：指发育生物体的严重的解剖学上形态结构的缺陷(异常）对发育、生长、生理功能、生育力和（或）寿命可产生有害影响，可以存活也可能不能存活
      • 致畸物：凡在一定剂量下，能通过母体对胚胎或胎儿正常发育过程造成干扰，使子代出生后具有畸形的化学物称为致畸物或致畸原。
      • 畸胎：具有畸形的胚胎或胎仔。
    • 变异(VARIATION)：指同一种属的子代与亲代之间或者子代的个体之间，有时出现不完全相同的现象，是小的或次要的结构改变
      • 变异是生命的一种特征，在生物学上具有适应与进化的意义，变异并非畸形，但有时与畸形难于严格区分。
      • 例：肋骨或椎骨数目多于或少于正常，甚至某些内脏易位也属于变异
    • 子胚胎-胎体毒性
      • 胚体毒性(embryo toxicity)：通常是指外源性理化因素造成的孕体着床前后直到器官形成期结束的有害影响。
        • 表现为：胚胎期染毒而出现畸胎、生长迟缓、着床数减少和吸收胎，也偶有晚死胎
      • 胎儿毒性(fetotoxicity)：指器官形成期结束后的因素引发的任何毒性表现。
        • 包括死亡、体重降低、骨化迟缓、功能缺陷以及结构异常，甚至肿瘤。在实验动物发育毒性试验中，通常不去区分胎儿与胚胎，所以使用胚体-胎儿毒性更恰当。
    • 发育毒性(developmental toxicity)：指出生前经父体和/或母体接触外源性理化因素引起的在子代到达成体之前内出现的有害作用。包括①结构畸形②生长迟缓③功能障碍④死亡
      • 发育毒物 (developmental toxicant）：能造成发育毒性的物质。发育毒物应是在未诱发母体毒性的剂量下产生发育毒
    • 出生缺陷 (birth defect)：是指婴儿出生前即己形 成的发育障碍。
      • ① 形态结构异常：畸形② 功能缺陷：如智力低下，代谢和行为的异常。
    • 不良妊娠结局 (adverse pregnacy outcomes)：指妊娠后不能产生外观和功能正常的子代，包括所有不良的不良结果，如流产、死胎、死产、宫内生长迟缓、新生儿和婴幼儿期死亡。
  • 2.2发育毒性作用的特点和影响因素
    • 发育各阶段发育毒性作用的特点和致畸敏感期
      • 着床前期
        • 从受精算起，到完成着床之前（人类为11-12天，啮齿类动物为前6天）通常是未分化细胞受化学毒物损伤而致胚泡死亡，即着床前丟失也有着床前接触毒物导致畸形的例子，如环氧己烷、甲基亚硝脲等
      • 器官形成期
        • 发育中的胚胎对致畸作用的敏感期虽然主要在器官发生期，但在此期间，各种不同器官还各有特别敏感的时间，即"靶窗〞 (target window).
        • 大鼠器官发生期为受精后9～17天，但眼的最敏感期为受孕后9天，心脏和主动脉弓约为9~10天。
        • 在器官发生期中，致畸物与胚胎接触可能造成形态 结构异常；也有可能发生胚胎死亡、生长迟缓。
      • 胎儿期
        • 器官形成结束后即进入胎儿期，人类从妊娠56~58天开始，直到分娩。在胎儿暴露期的一些毒性效应可能需要多年才变得明品胎儿期不良作用表现：生长迟缓、特异的功能障碍、经胎盘致癌、偶见死胎。
      • 围生期和出生后的发育期
        • 主要表现：发育免疫毒性、神经行为发育异常和儿童期肿瘤
        • 围生期：怀孕第28周到出生后一周的时期称为围生期。
        • 发育免疫毒性：妊娠期或围生期接触某些外源性化学物，会严重影响出生后T细胞、B细胞和吞噬细胞的发育、迁移、归巢和功能
        • 发育神经毒性：表现为对感觉、运动、自主和认知的影响
        • 儿童期肿瘤：围生期是一生中对致癌物最敏感的时期，许多儿童期高发的肿瘤（急性淋巴细胞性白血病、神经母细胞瘤、骶骨前畸胎瘤、胚性腺瘤等）都可能与出生前因素有关
    • 发育毒性的剂量-反应模式和阈值问题
    • 发育毒性的物种差异
      • 由于物种之问的代谢差异、胎盛种类、胚胎发育的速度和方式的差异引起。
  • 2.3母体毒性对发育毒性的影响
    • 母体毒性(maternal toxicity)是指外源化学物在一定剂量下，对受孕母体产生的损害作用。具体表现：体重减轻、出现某些临床症伏、死亡
      • 影响因素：遗传，疾病，营养，应激，胎盘毒性
    • 母体毒性与发育毒性
      • 轻度母体中毒的表现应限于母体体重下降，正常增长受到抑制。抑制程度，不超过不接触受试物对照组动物的10%
      • 严重母体中毒可出现体重增长大幅度抑制、持久性呕吐、过度安静或活动过度、呼吸困难、生育机能明显受损及其它中毒症状，甚至死亡。
      • 分类
        • 1.具有致畸作用，但无母体毒性出现，称为非共效应致畸物。此种外源化学物的致畸作用具有特定的作用机理，与母体毒性无关，如反应停,此种受试物致畸作用往往较强，应特别注意
        • 2.出现发育毒性的同时也表现母体毒性，称为共效应致畸物。此种受试物可能既对胚胎有特定的致畸机理，同时也对母体具有损害作用，但二者并无直接联系;也可能发育效应是母体生理学紊乱的继发效应。
        • 3.仅具有母体毒性，但不具有致畸作用，这类化学物妊娠期容易引起警觉，避而远之。
        • 4.在一定剂量下，既无母体毒性，也不表现胚胎毒性
        • 应在动物可能耐受条件下，最大限度地增加剂量，使其远远高于人类实际可能接触的水平，如仍未出现致畸作用，才做出结论.母体毒性与致畸作用的剂量关系之间，并无固定比值；一般情况下，致畸作用剂量较母体毒性作用剂量低
  • 2.4父源性发育毒性 (male-mediated birth defect)
    • 父亲源性发育毒性的主要表现
      • 父源性出生缺陷的因素主要有 遗传缺陷 年龄因素 外界暴露因素 （职业 环境暴露 化疗与放疗 药物 饮酒 抽烟等不良嗜好）
      • 父源性发育毒性的主要表现 自然流产 儿童肿瘤 男女出生比例失调
    • 父源性因素和发育毒性的关系
      • 父源性发育毒性和出生缺隆的机制还不清楚，环境因子造成雄性生殖细胞发育异常父亲职业有关的家庭环境污染（职业暴露对精子的影响或母亲的污染间接起作用）
  • 2.5人类发育毒物或致畸形物
    • 1、己烯雌酚 (diethystilbestrol,DES)主要发育毒性表现生殖器官畸形和癌症。男性后代 尿道下裂 附睾和睾丸异常，精子畸形，精液异常前列腺素癌和睾丸癌患病风险增加：女性后代，患输卵管癌，宫颈及阴道透明细胞癌风险增加
    • 2、反应停 (thalidomide)主要表现 四肢短小，无眼，腭裂，骨骼发育不全，十二指肠和肛门闭锁
    • 3、甲基汞 (methylmercury)水俣病 末梢感觉障碍，中心视野缩小，高频域听力障碍及运动失调。
    • 4、铅，容易造成儿童智商明显降低，注意力缺陷多动症、阅读和学习能力减弱
    • 5、视黄酸，主要表现中枢神经系统、颌面部和泌尿生殖系统畸形，智商低下。
    • 6、酒精和烟草，酒精综合征 (fetal alcohol syndrome FAS) 典型表现为面部畸形，宫内和产后生长迟缓、精神运动和智力发育障碍。烟草综合征 (fetal tabacco syndrme） 吸烟与胎儿生长发育迟缓，引起的胚胎毒性有流产、死胎、低出生体重。
• 3.致畸（发育毒性）作用机制
  • 3.1基因突变与染色体畸变
    • 有些外来化学物作用于生殖细胞或体细胞，都可诱发基因突变和染色体畸变，以致DNA的结构和功能受损，造成胚胎正常发有障碍，出现畸形,并具有遗传性。特别是在常规的致畸试验中，胚胎与受试物接触，己进入器官发生期。仅只能作用于体细胞，与生殖细胞无关。
  • 3.2细胞损伤与死亡
    • 细胞凋亡在胚胎发育形态发生中扮演重要较色，包括系统匹配、躯体雕刻、短暂结构去除。反应停诱导胚胎细胞调亡，抑制眱岛素样生长因子I(IGF-1）及纤维母细胞生长因子 (FGF）的基因复制而阻止表达，导致胎儿畸形小鼠暴露致畸剂量的RA(全反式视黄酸)发现畸形部位凋亡增加
  • 3.3干扰细胞与细胞间交互作用
    • 反应停的代谢活化产物引起胚胎细胞的粘联受体下调，阻碍发育过程中细胞与细胞、细胞与基质之间的相互作用，干扰了细胞之间的通讯从而导致肢芽结构异常。 目前，已证实多种致骑物，如灭蚊灵、杀鼠灵、苯巴比妥、氯丙嗪、苯妥英钠、多种烷基乙（撑）二醇醚和乙醇，都可以抑制纽胞的缝隙连接通讯。
  • 3.4通过胎盘毒性引起发育毒性
    • 对卵黄囊或绒毛膜尿囊胎盘有毒性的毒物有46种，包括镉、砷或汞、香烟、乙醇、可卡因、内毒素、水杨酸钠等。 证据 妊娠大鼠体内注入Cd造成胎盘血流减少发生胎儿死亡，并没有Cd进入胎儿体内。
  • 3.5干扰母体稳态
    • 二氟苯水杨酸→母体贫血、红细胞ATP水平损耗→兔的中轴骨骼缺陷 苯妥英→母体叶酸代谢→致畸 羟基脲→子宫血流减少→胚胎颅面和心包出血 孕妇缺乏代谢前体或基质（如维生素、碘的缺乏）
  • 3.6宫内重编程与胚胎发育毒性
    • 表观遗传修饰机制：甲基化，组蛋白修饰，RNA调控，染色质重塑 证据：宫内营养不良增加子代羅患心血管疾病、代谢性疾病、神经精神疾病的风险。
    • 重编程主要指是指在DNA序列不发生改变的情况下，基因的表达与功能发生改变，并产生可遗传的表型 分化细胞逆转到全能状态的过程；一种分化细胞转化为另一种分化细胞的过程。 宫内重编程指孕期不良宫内环境所致胎儿物质代谢或结构功能的改变
• 4.发育毒性和致畸作用试验与评价
  • 任何环境有害因素的损害效应都存在物种及个体差异。但在致畸作用中较突出。同一物种动物的不同品系对一种致畸物敏感性的差别很大。物种及种间差异，可能是由于遗传因素，即基因型差异。上化学物的致畸作用以及发育毒性的评定，主要通过动物试验得出评定结果后推论到人类。致畸作用物种品系差异，可能存在对动物不具致畸，但对人类有致畸作用，动物致畸试验结果推论到人类造成某些困难。所以对致畸作用的全面评定，必须采用两种动物进行试验，还要进行人群调查。
  • 4.1哺乳动物发育毒性试验
    • 大鼠和家免产前发育毒性试验 (OECD GL414):大鼠发育神经毒性试验 (OECD GL426);与重复给药相结合的大鼠生殖/发育毒性试验 (OECD GL422)；大鼠一代生殖毒性试验 (OECD GL443)
    • 目前管理毒理学生殖毒性实验的方案主要有三段生殖毒性试验、一代或多代生殖毒性试验，三段生殖毒性实验主要用于评价药物和医药相关的生殖毒性，一代和多代生殖毒性试验主要评价食品添加剂、农药及其他化学物的生殖毒性
    • 发育六阶段：A.从交配前到受孕B.从受孕到着床C.从着床到硬腭闭合D.从硬腭闭合到妊娠终止E. 从出生到离乳F.从离乳到性成熟
    • 三段生殖毒性试验：
      • 1生育力与早期胚胎发育毒性试验（一般生殖毒性试验）
      • 2胚体一胎体毒性试验（致畸试验）
      • 3出生前和出生后发育毒性试验（围生期毒性试验）
  • 4.2流行病研究和人类发育毒物的确定
    • 发育毒性的流行病学
      • 发育毒性研究的2个方案！病例对照研究，队列研究
    • 人类发育毒性的确定
      • 发育毒性流行病学研究的挑战 1. 十分肯定的生殖结局与暴露，毒效应明显、研究 人群的的样本量答，才能得出相对可靠的结论。例：丙戊酸 2.人群中妊娠的失败率很高，31%妊娠失败发生在 着床前后，15%临床可见流产
    • 致畸物及发育毒物的风险分类
      • 1.1989年国际生命科学院研究所 (Internationnal Life Science Institute ILST）根据动物试验中发育毒性效应类型、严重性和发生率，将化学物分为四类
      • ICH人类用药危险性分类
        • A.B.Cz类：仅在明显需要，或证明可能受益与对胎儿可能的危险比较是可取时，在怀孕期间可以使用 C1:仅在如果能证明可能效益对胎儿的可能危险性比较是可取时，妊娠期间可以使用 D类：在怀孕期间使用，应通知病人对胎儿可能的危害 X：怀孕或可能怀孕的妇女中禁止使用
  • 4.3发育毒性的初筛和替代试验
    • 在生物医学研究、检测或教育中凡是能替代实验动物、减少所需动物数量或使动物实验程序得以优化而减少动物痛苦的任何一种方法或程序，都被认定为是替代方法
      • 代替替代 (Replacement alternative） 减少替代 (Reductionalternative) 优化替代(Refinement alternative)
      • 包括用组织学、胚胎学、细胞学或计算机等方法取代整体动物实验，以低等动物取代高等级动物
    • 体内初筛试验
      • 原理：大名数出生前受到的损害将在出生后表现为存活力下降和生长障碍。（大鼠）
    • 体外预筛试验
      • 由于删除了母体毒物动力学、生物转化，以及胎盛屏障的影响，因此其可靠性受到一定的怀疑；其中大鼠全胚胎培养试验、大鼠胚胎肢芽微团试验、小鼠胚胎干细胞试验比较公认。
      • 大鼠全胚胎培养
        • 可用孕d9-d10的大鼠胚。此法经Schmid和Cicurel进行可靠性验证，灵敏度为100%，特异度分别为95.2%。观察胚胎存活、肢芽与卵黄直径、体节数，胚胎重作为胚胎发育指标。以胚胎的心跳和血液循环是否存在作为胚胎存活的指标。采用Brown评分对器官形态分化作出评价
      • 胚胎细胞微团培养
        • 取孕期第11天的大鼠胚胎取得代表CNS的原代中脑细胞微团、肢芽区或其他区的细胞微团，在培养瓶中加入不同浓度的受试物共同培养5天，用不同的染色剂染色判断细胞存活与分化数量，比较受试物与对照组数据，评价化学物的细胞毒性与发育毒性
      • 小鼠胚胎干细胞试验
        • 小鼠胚泡内细胞团衍生的胚胎干细胞在特定的条件下，可定向分化为机体多种细胞，因此哺乳动物细胞分化，组织形成过程的发育毒性。