第七章一般毒性作用

一般毒性作用：也称基础毒性，机体对外源化学物的非特异性毒性反应，与特殊毒性（致畸、致突变、致癌）相对而言。

第七章一般毒性作用

• 概述
  • 一般毒性作用：也称基础毒性，机体对外源化学物的非特异性毒性反应，与特殊毒性（致畸、致突变、致癌）相对而言。
  • 一般毒性评价和研究主要目的
    • 确定受试物毒作用的表现和性质
    • 确定受试物毒作用的剂量-反应关系
    • 确定毒作用的靶器官
    • 确定损害的可能性
  • 根据接触毒物的时间长短
    • 急性/亚急性/亚慢性/慢性
  • 化学物质毒作用特点的参数
    • 急性毒作用带
    • 慢性毒作用带
• 急性毒性作用
  • 概念
    • 急性毒性：指实验动物一次接触或24小时内多次接触一定剂量的某种外源化学物在短期内所产生的健康损害作用和致死效应。
    • 不同给药途径“一次接触”的内涵 经口和注射接触，“一次〞是指一次操作瞬间将受试化学物输入实验动物体内。 经呼吸道吸入与经皮肤接触，〝一次〞是指在一段规定的时间内实验动物持续地接触受试化学物的过程。
    • 中毒效应出现的时间：“一次或24小时内多次接触〞后所产生的毒性效应。观察时间一般为7天-14天，如有必要可延长至14天以上。
  • 目的
    • 1.急性毒性试验可确定受试物的一系列急性毒性参数半数致死剂量LD50、绝对致死剂量LD100、最小致死剂量LD01，最大非致死剂量LD0，也可得到急性LOAEL和急性NOAEL。
    • 2.通过观察实验动物的中毒表现和死亡情况，初步评价受试物对动物的毒性和人体产生损害的危险性大小、毒效应的特征、靶器官和剂量-反应关系。
    • 3.为亚急性、亚慢性和慢性毒理学实验以及其他毒理学研究的染毒剂量设计和观察指标选择提供和建议。
    • 4.为毒作用机制研究提供初步线索。
  • 试验方法要点
    • 动物选择
      • 1.物种：对受试物的吸收、代谢、生化和毒理学特征与人最接近的；自然寿命不太长：易于饲养操作；经济易得。 2.品系：固定品系实验结果稳定。 3.微生物级别：清洁级或以上。 4.性别：考虑性别差异。 5.年龄和体重：急性试验用成年，亚慢性和慢性试验用较年幼或初断乳的动物。体重均数士20% 6.生理与健康状況：未产孕、健康等。实验前观察5-7天。
    • 急性毒作用观察
      • 中枢神经系统和神经肌肉系统：体位异常、叫声异常、不安、呆滞、痉李、抽搐麻痹、运动失调、对外反应过敏或迟钝； 植物神经系统：瞳孔扩大或缩小、流涎或流泪； 呼吸系统：鼻孔流液、鼻翼煽动、呼吸深缓、呼吸过速、蜂腰； 泌尿生殖系统：会阴部污秽、有分泌物、阴道或乳房肿帐; 皮肤和毛：皮肤充血、紫绀、被毛蓬松、污秽： 眼：眼球突出、结膜充血、角膜混浊； 消化系统：腹泄、厌食
    • 经典的急性毒性试验
      • 基本方法
        • 1）实验动物的选择 2）受试物的特殊性质、毒性反应 3）设置剂量组：至少3组，组间有适当的计量间距，可观察到明显的毒性和不同的死亡率，以得到剂量-反应关系并求得LD50 4）观察并记录：记录每种症状发生时间、表现程度、各症状的发展过程、死亡前特征和死亡时间。 5）所有动物均应大体尸体解剖检查 **如果在研究中发现待测化学物对雌、雄动物的毒性大小有明显差异时，应分别求出雌性与雄性动物各自的LD50值；如果试验是为致畸试验作剂量准备，也可仅做磁雌性动物
        • 染毒方式
          • 吸入（呼吸道）：静式吸入，动式吸入
          • 经口（消化道）：灌胃法，胃饲法，胶囊法
          • 经皮染毒：浸尾法，定量法
          • 注射染毒：腹腔，肌下，皮下，静脉
        • 动物分组：均衡性和随机性
      • LD50的计算方法
        • 曲线拟合法，插值法，加权最小二乘法，简化概率法，累计法，面积法等，我国常用的是改良寇式法和霍恩氏法
      • 经典的急性毒性试验的缺点和局限性
        • ◎使用动物量大，一次试验60～100只动物； ②获得信息有限； ③测得LD50值实际上仅是近似值且波动性很大。
    • 急性毒性代替试验
      • 限量试验
        • 适用范围：受试物毒性很低，可使用限量试验
        • （大鼠或小鼠各20只，雌雄各半）10g/（kg•BW)剂量，如达不到则给与最大浓度和最大体积，染毒后连续观察14天，如动物无死亡，则认为该受试物经口急性毒性耐受剂量大于灌胃剂量。如果出现动物死亡则选用其他方法
      • 固定剂量法
        • 适用范国：受试物毒性很低，可使用限量试验。
        • 第一阶段5、50、300或2000mg/kg观察指标是明显毒性（非死亡）。 第二阶段预实验后，一般只需1个剂量，只需5只动物（包括预实验在该水平做过的动物）。如果2000mg/kg预实验和正式试验都不出现中毒表现，则终止实验。平均用动物14.8只。
      • 急性毒性分级试验法
        • 每次选用5、50、300或2000mg/kg中剂量之一，单性别3只动物进行试验，每次试验后依据固定判别表格，根据结果进行毒性分级。
      • 上-下法
        • 该法适用于纯度较高、毒性剂量较大、摄入量小旦在给与受试物后动物1~2天内死亡的受试物，在预期给予受试物在5天及以后死亡的受试物不适用。 上下法仅需6~10只单性别动物。
        • 终止实验：
          • 在较高剂量给予受试物中连续有3只动物存活-终止试验 连续6只动物给予受试物后出现5个相反的结果-终止试验
  • 急性毒性分级
• 局部刺激作用
  • 概述
    • 概念：局部刺激作用指机体暴露于化学物后，在其接触和暴露部分造成的局部损伤和刺激，如眼刺激和皮肤刺激作用
    • 实验目的：了解外源化学物对皮肤、眼睛的局部刺激性、腐蚀性和致敏性。
  • 眼刺激试验
    • (1）观察终点：化学物导致的眼刺激性和眼腐蚀性。
    • (2）传统方法：家免眼刺激试验，亦称Draize试验。
      • 原则：受试物以一次剂量滴入每只实验动物的一侧眼结膜囊内，另一侧未作处理的眼作为对照观察指标：结膜（发红、球结膜水肿和分泌物）、角膜（混浊程度和范围）、虹膜（充血、肿胀和角膜周围充血）。
    • 时间：观察期限一般为7天，必要时可延长至21
    • 分类
      • 眼刺激试验(eyeirritationtest)观察眼球表面接触受试物后所产生的可逆性炎性变化。
      • 眼腐蚀性(eyecorrosion）是指眼球表面接触受试物后引起的不可逆性组织损伤。
      • 只有对皮肤腐蚀试验的结果为阴性时，才考虑进一步进行体内眼刺激/腐蚀性试验。对皮肤产生强刺激作用的强酸或强碱性物质，一般无需再做眼刺激试验
    • 眼刺激试验替代法
      • 用非实验动物组织代替眼兔-受精鸡卵鸟囊绒膜试验
      • 检测细胞膜损伤的溶血试验(hemolysistest)
        • 试验原理接触受试物所导致的细胞膜损伤可使膜渗透性发生改变，血红蛋白从红细胞中漏出而发生溶血。
      • 检测血红蛋白变性
        • 用血红蛋白标品与受试物共同孵育，评价其使蛋白质变性的程度。
      • 细胞毒性试验
        • 兔眼角膜上皮细胞、非眼组织细胞（HeLa细胞），观察细胞增殖、膜完整性和细胞形态学的变化。
      • 生物膜型替代法和其他非生物实验法
        • 使用培养的立体人皮肤作为眼刺激模型来进行细胞毒性试验，植物蛋蛋白变性来检测受试物的眼刺激性。
  • 皮肤刺激试验
    • (1)皮肤刺激试验包括单次和多次皮肤刺激试验、完整皮肤和破损皮肤刺激试验等，
    • (2)观察终点:皮肤刺激和皮肤腐蚀性。
    • (3)经典的皮肤刺激实验：Draize法：动物为家免，背部皮肤进试验。可用同体对照。一般在接触4小时后观察皮肤的刺激性，按照评分规则进行评分判别刺激强度。
    • 以下几种情况无需进行皮肤试验： ⑨受试物为强酸强碱pH≤2或≥11.5 ②经皮LD50≤200mg/kg ③急性经皮毒性试验中受试物剂量达到2000mg/kg体重仍末出现刺激性作用。
    • 分类
      • 皮肤刺激：指皮肤接触或涂敷受试物后，局部产生可逆性炎性变化;
      • 皮肤腐蚀性：皮肤接触或涂敷受试物后，引起了局部的不可逆组织损伤。
    • 皮肤刺激试验替代试验
      • 单层皮肤细胞培养模型
      • 表皮组织培养模型
      • 器官型人工皮肤皮肤模型
      • 人工皮肤表皮结构完整分化完全；能与受试物接触，旦不受剂型和溶解性的限制，与动物实验结果的相关性好。
  • 皮肤变态反应试验
    • (1)概念：皮肤对化学物产生的免疫源性皮肤反应
    • (2)观察终点：观察实验动物皮肤红斑和水肿等反应。
    • (3)目的：确定重复接触外源化学物是否可引起变态反应及其反应的程度。
    • (4)原理：皮肤第一次接触外源化学物可能产生较轻的反应或无明显反应，但经过一段时间（致敏期）再次接触同一物质或类似物质，可能引起迟发性超敏反应，旦在最初接触或染毒的部位以外的皮肤也可发生。一般是采用三次接触之后，再激发观察致敏强度。
    • (5)方法：局部封闭涂皮法（BT）、豚鼠最大值试(GPMT)局部淋巴结试验(LINA)
    • 皮肤变态反应试验替代试验
      • 基于树突状细胞及T细胞等在接触性过敏性皮炎发生过程中“免疫识别〞化学过敏原的关键免疫细胞，发展利用这些细胞系建立相关模型
      • 建立化学物渗透表皮生发层/真皮层的皮肤模型
      • 角质形成细胞培养模
• 短期、亚慢性和慢性毒性作用
  • 概述
    • 概念
      • (1)短期毒性作用（重复剂量毒性作用、亚急性毒性作用）指实验动物或人连续接触外源化学14~30天所产生的毒效应。
      • (2)亚慢性毒性作用，指实验动物或人连续较长期（约相当于其生命周期的1/10）接触外源化学物所产生的中毒效应。
      • (3)慢性毒性作用，指实验动物或人长期接触外源化学物所引起的毒性效应（对啮齿类动物，一般至少12个月，亦可终身染毒）。
    • 蓄积作用：指外源化学物连续、反复地进入机体，而且吸收速度或总量超过代谢转化排出的速度或总量时，化学物质就有可能在体内逐渐增加井贮存，称为化学物的蓄积作用。
      • 检测：理化方法，生物学方法
    • 共同目的
      • 1.毒性效应谱、毒作用特点和毒作用靶器官。 2.探索受试物的毒作用机制。 3.观察长期接触受试物毒性作用的可逆性 4.确定长期接触受试物所致毒性作用的计量反应关系、确定NOAEL和LOAEL，为制定人类接触的安全限量提供依据。 5.比较不同动物物种、不同接触时向的毒效应的差异，为受试物毒性机制研究和将研究结果外推到人提供依据。
  • 研究方法
    • 短期毒性和亚慢性毒性试验
      • 实验动物的选择
      • 物种和品系
        • 选择已有资料证明对受试物敏感的实验动物种系亚慢性毒性作用研究一般要求选择两种实验动物，一种为啮齿类，另一种为非啮齿类，如大鼠(Wistar, Sprague-Dawley)和狗 (Beagle大），以便全面了解受试物的毒性特征。 亚慢性：首选大鼠
      • 性别、年龄，动物数
        • 由于亚慢性毒性试验期较长，所以选择被动物的体重(年龄)应较小（离乳不久动物），如小鼠应为15g左右，大鼠50~100g左右不超过6周
      • 染毒途径和染毒期限
        • 亚慢性毒性试验接触外源化学物途径的选择，应考虑两点：
          • 1.尽量模拟人类在环境中接触该化合物的途径或方式；
          • 2.应与预期进行慢性毒性试验的接触途径相一致 具体接触途径主要有经口、经呼吸道和经皮肤三种
          • 3.染毒频率经口每日1次，每周5或6次：呼吸道染毒每日2~6小时，OECD亚慢性吸入染毒，要求在染毒柜中受试物浓度达到平衡后，持续4小时；注射染毒注意无菌操作。
        • 剂量设计原则
          • 最高剂量组的染毒剂量应使动物在染毒期间产生较明显的毒性，但不应引起动物死亡和承受明显的痛苦，即使有死亡，也应小于10%的动物数。通常以该化学物急性毒性的闭剂量（同一动物品系和同样的染毒途径）或以该化学物的1/20-1/5LD50作为最高染毒剂量；
          • 最低剂量组的动物应无中毒反应或仅有极其轻微的反应，相当于亚慢性的阈剂量或NOAEL水平。
          • 在低、高剂量组之间再设置1个中间剂量组（约相当于LOAEL）。组间隔一般为2-4倍。
          • 对照组除不染毒外，其他处理与染毒组动物相同
      • 观察指标
        • 一般性指标
          • 外观体征，行为活动
          • 动物体重
            • 可将接触组与对照组同期体重绝对增长的重量或体重百分增长率(以接触化学物开始时动物体重为100%)进行统计和比较。
          • 食物利用率
            • 是指动物每食入100g饲料所增长的体重克数。分析比较接触组与对照组食物利用率，有助于分析受试化学物对实验动物的生物学效应
          • 症状
            • 试验期间至少每天相同时间对动物进行一次临床观察，最好在染毒后预期中毒症状出现的高峰期。每天至少两次检查动物有无濒死征象或死亡。
          • 血液学指标
            • 包括红细胞计数、白细胞计数和分类、血红蛋白定量、血小板等
          • 血液生化指标
          • 系统尸检和病理学检查
            • 脏器系数（称脏/体比值)：是指某个脏器的湿重与单位体重的比值，通常以100g体重计
      • 观察时间
        • 短期毒性实验停止给予受试物后继续观察14天，90天亚慢性毒性试验停止给予受试物后继续观察28天
      • 可逆性观察
        • 最后染毒后24小时，每组活杀动物(如2/3)，检测各项指标，剩下停止染毒，继续观察2～4周。如病理学检查发现有异常变化，应将剩下动物活杀刨检，重点观察毒性反应器官。
    • 慢性毒性试验
      • 慢性毒性(chronictoxicity)：是指实验动物或人长期（甚至终生）反复接触外源化学物所产生的毒性效应
      • 目的：确定在实验动物的大部分生命期间重复给予受试物而引起的慢性毒性，阐明受试物的剂量-反应关系和靶器官，并确定慢性毒性的NOAEL和LOAEL预测人群接受该受试物后可能发生慢性毒性的危险性，并为接触人群的接触限值提供依据
      • 实验动物选择
        • 实验动物最好为纯系甚至同窝动物均匀分布于各剂量组。 实验动物年龄应较小，大鼠和小鼠应为初断奶者，即小鼠出生后3周，体重10~12g;大鼠出生后3~4周，体重50~70g。性别要雌雄各半
      • 染毒剂量和期限
        • 一般设了个染毒剂量组和1个对照组，必要时另设一个溶剂对照组，即无作用剂量组、问剂量组、发生比较轻微毒性效应的剂量组(此为最高剂量组）。组间剂量差一般以2～4倍为宜，不宜超过10倍
        • 实验期限一般至少12个月
        • 染毒途径多为经口与经呼吸道接触
      • 观察指标与亚慢性毒性试验相同