第八章 外源化学物致突变作用

致突变作用(mutagenesis)是指外来因素特别是化学因子引起细胞核中的遗传物质发生改变的能力，而且此种改变可随同细胞分裂过程而传递

第八章 外源化学物致突变作用

• 1.概述
  • 生物物种以相对稳定的状态存在于自然界，并繁衍子代，这个过程称为遗传(heredity)
  • 生物体历代之间或同一代不同个体之间出现不同程度的差异称为变异(variation).
  • 细胞内遗传物质结构发生的可以遗传的变异称为突变(mutation）
    • 自发突变(spontaneous mutation)：是由于普遍存在的未知因素作用下，在自然条件下发生的突变
      • 特点：发生过程长、频率很低，与物种进化有关
    • 诱发突变(induced mutation)：是指人为地造成突变
      • 特点：发生过程短、频率高，既可被人类利用，也可能对人类产生危害
  • 由于化学、物理、生物学等环境因素引起的突变，也可以是由于某些目的而认为的构建突变。
  • 致突变作用(mutagenesis)：是指外来因素特别是化学因子引起细胞核中的遗传物质发生改变的能力，而且此种改变可随同细胞分裂过程而传递
  • 致突变物(mutagen)：凡能引l起生物体遗传物质发生改变的化学物质或任何环境因子，又称诱变剂
    • 直接致突变物：具有很高的化学活性，其原型就可引起生物体突变的物质
    • 间接致突变物：本身不能引起突变，必须在体内经过代谢活化，才具有致突变性的物质
  • 遗传毒理学(genetictoxicology)：研究化学性和放射性物质的致突变作用以及人类接触致突变物可能引起的健康效应的科学
  • 遗传毒物(genotoxieagent)：由于致突变物能损伤遗传物质，因此致突变物为遗传毒物一种
• 2.突变类型
  • 突变(mutation)：是指遗传结构本身的变化及其引起的变异，即生物体的遗传物质发生了突然的、根本的、遗传的变化，因为这种变化起源于基因和染色体，因此，是可遗传的变异
  • 基因突变通过生长发育、生化形态等表型改变来判断，不能用光学显微镜直接观察。而染色体结构，数目改变是可以用显微镜直接观察的
  • 基因突变
    • 基因突变(geneticmutation)：是指基因中DNA碱基序列的变化，基因突变通常发生在基因某一特定位点，因此又称为点突变(pointmutation)。
      • 突变基因：基因内存在突变的基因 野生型基因：没有发生突变的基因
    • 碱基置换：碱基置换是指DNA多核苷酸链上某个碱基被另一种碱基取代导致DNA碱基序列的异常。
      • 转换(transition)：即嘌呤到嘌呤或嘧啶到嘧啶的变化
      • 颠换(transversion)：即嘌呤到嘧啶或嘧啶到嘌呤的变化
      • 后果
        • 同义突变：指没有改变基因产物氨基酸序列的改变;
        • 无义突变：是由于某个碱基的改变使编码某种氨基酸的密码子变为终止密码子，从而使肽链提前终止
          • 链终止突变：指无义突变使肽链过早终止
          • 延长突变：指如果终止密码子因突变而为氨基酸编码结果产生过长的肽链的现象。
        • 错义突变：指DNA分子中的碱基被置换后形成新的密码子，导致所编码的氨基酸种类发生改变；
          • 致死突变：发生在必需基因上，严重影响 蛋白质功能的错义突变
          • 渗漏突变：突变的产物仍有部分活性，表 现型介于突变型与野生型之间
          • 中性突变：突变不影响或基本不影响蛋白 质的功能，性状改变不明显
    • 移码突变(frameshiftmutation)：指在DNA碱基序列中，插入或缺失一对或几对不等于3的倍数的碱基，以致从受损点开始按三联密码连续阅读规则，该部位以后的密码子组成全部改变，导致合成的多肽链也发生改变。
    • 密码子插入或缺失：基因突变中，如果减少或增加的碱基刚好是3，则称为密码子的的缺失或插入，基因产物肽链中减少或增加一个氨基酸。不包括在移码突变范畴。
  • 染色体畸变
    • 染色体结构异常（畸变）(structural chromosomeaberration)：是指由于染色体或染色单体断裂，造成染色体或染色单体缺失或引起各种重排，从而出现染色体结构异常
    • 染色体型畸变：染色体断裂不发生重接或虽重接而不在原处，染色体畸变涉及两条染色体。
      • 缺失（裂隙和断裂）：都是指染色体上狭窄的非染色带，过去以带竞超过染色单体竞度为断裂，不超过者为裂隙，染色体发生断裂而不重接，出现染色体片段丢失。
      • 插入：当一个染色体发生三处断裂，带有两断端的断片插入到另一臂的断裂处或另一染色体的断裂处重接起来，称为插入
      • 重复：在一套染色体里，一个染色体片段出现不止一次
      • 倒位(inversion)：当某一染色体发生两次断裂后，其中间节段倒转180°再重接，称为倒位。
      • 易位：从某个染色体断下的节段接到另一染色体上称为易位
      • 环状染色体：染色体两臂各发生一次断裂，其带有着丝粒的节段的两断端连接形成-一个环时，称为环状染色体
      • 双着丝粒染色体：两个染色体断裂后，两个有着丝粒的节段重接。
      • 无着丝粒断片和缺失(deletion)：一个染色体发生一次或多次断裂而不重接，并且这些己断裂的节段远远分开，就会出现一个或多个无着丝粒断片和一个缺失了部分染色质并带有着丝粒的异常染色体，后者称为带着丝粒断片
    • 染色体单体型畸变：畸变涉及一条染色体。
  • 基因组突变
    • 动物正常体细胞染色体数目2n为标准，为二倍体，又称双体(disomy)。染色体数目异常可能表现为整倍性畸变和非整倍性畸变。
    • 整倍性畸变可能出现单倍体、三倍体或四倍体。超过二倍体的整倍性畸变也统称为多倍体。非整倍性畸变系指比二倍体多或少一条或多一条染色体(2n+1,2n-1)
    • 缺体是指缺少一对同源染色体，单体或三体系指某一对同源染色体相应地少或多一个，四体则指其比同源染色体多一对； 于是在染色体数目上相应为2n-2、2n-1， 2n+1和2n+2 人类中常见有三种三体： (1）21-三体，即Down氏综合征； (2） 18-三体，即Edward综合征 (3） 13-三体，即Patau综合征。
• 3.DNA损伤的修复
  • 直接修复
    • 光复活修复(photoreactivation)：在光裂合酶的作用下，修复紫外线损伤产生的胸腺嘧啶二聚体，此修复广泛存在原核和真核生物体内。
    • 烷基转移酶修复：主要是O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT)修复鸟嘌呤O6位的烷基化损伤，将烷化碱基又变成正常的碱基。
  • 碱基切除修复
    • (1）识别：糖基化酶识别异常的碱基，随后使异常嘌呤的N-9位或异常嘧啶的N-3位与脱氧核糖之间的键发生水解，形成无嘌呤或嘧啶的位点（apurinic-apyrimidinic site, AP位 点） (2） 插入酶将正确碱基插入AP位点 (3）DNA聚合酶合成DNA片段，填补空缺 (4）DNA连接酶将新合成的补片接上
  • 核苷酸切除修复
    • 损伤识别
      • 蛋白复合体结合到损伤位点----在错配位点上下游几个碱基的位置上（上游5’端和下游3‘端）将DNA链切开---将两个切切口间的寡核苷酸序列清除----DNA聚合酶合成新的片段填补gap---连接酶将新合成片段与原DNA链连接起来
    • 损伤两侧切开损失链
    • 切除寡聚核苷酸
    • 修复合成填补产生的空缺
    • DNA链接酶封闭
  • 双键断裂修复
    • 同源重组修复
    • 非同源重组修复
  • 交联修复
    • 当细胞内DNA链内交联，会造成双联的断裂，机体主要启动无误交联修复机制进行修复，还存在另一种易误交联修复机制
    • 易错修复(error-pronerepain)：是指突变作为修复的结果或作为损伤旁路发生的DNA修复
    • 光复活、适应性修复和切除修复倾向于无误修复
    • 呼救性修复（SOS）修复就是易错修复
      • SOS修复特点：诱导性修复/修复过程有明显的错误/SOS系统为多基因控制
  • DNA损伤修复的一般特点
    • 1.DNA损伤不仅可因外源性因素所致，也可因内源性因素所致 2.不同类型DNA损伤通过不同的DNA修复途径修复 3.不同类型DNA损伤修复速度是不同的 4.DNA损伤修复机制有些是基本的，有些是可诱导的 5.DNA损伤修复功能存在物种和个体差异
• 4.致突变化学物及其作用机制
  • 概述
    • 细胞中DNA损伤和基因突变可以是自发性的，但更重要的是由于环境化学和物理因素引起的诱发性损伤。
    • 具有诱发DNA损伤和基因突变作用的外源化学物称为化学诱变剂 (chemical mutagen)
    • 化学物质诱导基因突变和染色体畸变的主要靶分子是DNA,诱导染色体数目改变的靶部位主要是有丝分裂或减数分裂的成分，如纺锤体。
  • 以DNA为靶的直接诱变作用
    • 碱基烷化
      • 烷化剂(alkylating agent):是指对DNA和蛋白质具有强烈烷化作用的物质。烷化剂提供甲基或乙基等与DNA共价结合，甲基化易产生碱基错配
      • 一般情况下甲基化＞乙基化＞高碳烷基化
      • 目前认为最常受到烷化的是鸟嘌呤的N-7位，其次是0-6位，腺嘌呤的N-1、N-3和N-7也易烷化
    • 碱基类似物取代
      • 有些化学物的结构与碱基非常相似，称碱基类似物它们能在S期中可与天然碱基竞争，并取代其位置 例： 5-溴脱氧尿嘧啶核苷能取代胸腺嘧啶；2-氨基嘌呤(2-AP）能取代鸟嘌呤
    • 碱基结构破坏
      • 化学物可对碱基产生氧化作用，从而破坏或改变碱基的结构，进而引起链断裂有些化学物质可在体内形成有机过氧化物或自由基，如甲醛、氨基甲酸乙酯和乙氧咖啡碱等，可间接使嘌呤的化学结构破坏，容易出现DNA链断裂
    • 平面大分子嵌入DNA链
      • 嵌入剂(intercalatingagent)：指能以静电吸附形式嵌入DNA单链的碱基之间或DNA双螺旋结构的相邻多核苷酸链之间的物质。
    • 二聚体形成
      • DNA同一条链上两个相邻的嘧啶核苷酸会发生共价连接，形成嘧啶二聚体。含有二聚体的DNA链不能作为复制的模板。二聚体的形式有CT，TT，CC
    • DNA加合物形成
      • 活性化学物质与细胞大分子之间通过共价键形成的稳定复合物如生物毒素、多环芳烃和芳香胺类致癌物可使DNA形成大加合物，使DNA的立体构象发生明显变化，阻断受损部位的半保留复制和转录
    • DNA蛋白质交联分子形成
      • (DNA-proteincrosslinks,DPC)如亚硝酸、丝裂霉素C、氮和硫的芥子气以及各种铂的衍生物
  • 不以DNA为靶的间接诱变作用
    • 干扰细胞的分裂过程
      • 一些化学物能作用于纺锤体，中心粒或其他核内细胞器，而干扰有丝分裂过程。秋水仙碱、长春碱可与微管蛋白二聚体结合影响纺锤体的正常功能。铅、锌、汞、砷等金属可以与微管上的巯基结合，使细胞分裂部分抑制
    • 对DNA合成和复制相关酶的影响
      • 一些氨基酸类似物可使与DNA合成有关的酶系统遭受破坏从而诱发突变，脱氧核糖核苷三磷酸在DNA合成时的不平衡也可诱发突变。
    • DNA修复抑制
      • 咖啡因、吖啶黄素、普鲁卡因、铍和锰除可直接与DNA相互作用外，还可与酶促防错修复系统相作用而产生突变
• 5.致突变作用的危害
  • 5.1体细胞突变后果
    • 癌变：体细胞突变是细胞癌变的重基础，在许多肿瘤中，都可观察到癌基因的活化和抑癌基因的失活，并存在缺失、易位、倒位等染色体畸变
    • 致畸胎：致突变物可透过胎盘作用于胚胎体细胞引起畸胎，所以致畸作用不完全是亲代生殖细胞突变的后果
    • 其他不良后果：动脉粥样硬化、衰老
  • 5.2生殖细胞突变后果
    • 致死性突变
      • 显性致死
        • 精子不能受精，或突变配子与正常配子结合后，在着床前或着床后的早期胚胎死亡。基因的致死作用在杂合子中即可表现的称为显性致死。（流产，死产）
      • 隐性致死
        • 需要纯合子或半合子才能出现死亡效应，杂合子则不出现死亡。（出生缺陷）
    • 非致死性突变
      • 显性存活
      • 隐性存活
  • 5.3遗传损伤对人类基因库的影响
    • 生物个体生殖细胞发生突变或染色体畸变后，有些可能会在世代传递、选择过程中在人群中固定下来，增加人类的遗传负荷。即增加下一代基因库(gene pool) 的遗传负荷(geneticload).
    • 基因库：某一物种在特定时期中能将遗传信息传下一代的处于生育年龄的群体所含有的基因总和。
    • 遗传负荷：指一种物种的群体中每一个携带的可遗传给下一代的有害基因的平均水平。
  • 5.4影响化学物致突变作用的遗传因素
    • 体细胞：其影响仅能在直接接触该物质的个体身体上表现出来，不会遗传到下一代
    • 生殖细胞：其影响有可能遗传到下一代（遗传性疾病）
• 6.化学物致突变作用的检测
  • 致突变试验的目的： (1）检测外源化学物的致突变性，预测其对哺乳动物和人的致癌性 (2）检测外源化学物对哺乳动物生殖细胞的遗传毒性，预测其对人类的遗传危险性
  • 6.1观察项目的选择
    • 观察效应终点的类型： (1）DNA完整性改变 (2）DNA重排或交换 (3）DNA碱基序列改变（基因突变） (4）染色体完整性改变（染色体畸变） (5）染色体分离改变（非整倍体和多倍体）
    • 试验组合的原则 (1)试验组应包括每一类型的遗传学终点，如细胞回复突变试验、微核试验、细菌DNA修复试验和体外姐妹染色单单体交换试验(SCE)，这一组试验包括主要类型遗传学终点 (2)试验组中的指示生物应包括几个进化阶段，至少要包括原核细胞与真核细胞两个系统 (3)试验组应包括体内试验与体外试验，体外试验（+S9和-S9)和体内试验细胞突变试验为阳性者有必要进行生殖细胞突变试验
  • 6.2常用的致突变试验
    • 是伤寒沙门氏菌回复突变试验（Ames试验）
      • 原理：检测受试物诱发鼠伤寒沙门氏茵组氨 酸营养缺陷型突变株(his回复突变成野生型 (his+)的能力
      • 组氨酸突变菌(his-）：在不含组氨酸的最低营养 平 皿上不能生长
      • 回复突变成野生型（his+)：可在不含组氨酸的最 低营养平皿上生长
      • 标准试验菌株有四种：TA97和TA98检测移码突变. TA100检测碱基置换突变、TA102对醛、过氧化物 及DNA交联剂较敏感 这四个试验菌株除了含有his-突变，还有一些附加 突变，以提高敏感性
      • 结果判断：只要在一种试验菌株得到阳性结果，即认为受试物是致突变物。仅当四种试验菌株均得到阴性结果，才认为受试物是非致突变物 不加S9混合液得到阳性结果，说明受试物是直接致突变物，加S9混合液才得到阳性结果，说明该受试物是间接致突变物
    • 微核试验MNT
      • 微核(micronucleus)：是指染色体无着丝点断片或因纺锤体受损伤而丢失的整个染色体在细胞分裂的后期仍留在子细胞的胞质内，成为一个或几个规则的次核
      • 常用啮齿类动物骨髓嗜多染红细胞(PCE)做微核试验PCE是红细胞成熟的一个阶段，此时红细胞的主核已排出，微核容易辦认，PCE胞质含RNA染色与成熟红细胞易于区别，故为骨髓微核试验的首选细胞群
    • 单细胞凝胶电泳（SCGE）
      • 原理：在电泳槽中，DNA断片在电场的作用下，由 细胞核中移出，并向阳极泳动，经荧光染色后见到 细胞核和移出的DN^断片，形成有如彗星一样的彗 星头和彗星尾，故又称彗星试验 (comet test)
    • 染色体畸变分析
      • 观察染色体形态结构和数目改变，又称细胞遗传学试验。将观察细胞停留在细胞分裂中期相，用显微镜检查染色体畸变和染色体分离异常。
    • 姐妹染色单体交换
      • 一条染色体的两条单体在同一位置发生冋源片段的变换，称为姐妹染色单体交换。由于交换是对等的，所以染色体的形成没有改变，但用特殊的培养液和处理方法可以显示出来
    • 果蝇伴性隐性致死试验
      • 利用隐性基因在伴性遗传中具有交叉遗传特征，选择黑腹果蝇，给雄蝇受试物，如雄蝇的X染色体有突变，传给F1代雌蝇，再通过F1代雌蝇传给F2代雄蝇，使位于x染色体上的隐性基因在半合型雄蝇表现出来。
    • 显性致死试验
      • 显性致死突变指哺乳动物生殖细胞染色体发生结构和数目变化，出现的受精卵在着床前死亡和胚胎早期死亡。它是评价化学毒物对雄性动物的生殖细胞遗传毒性较好的方法之一。
    • 荧光原位杂交技术
      • 利用荧光探针，将己标记或经特殊修饰的核酸探针与已固定的组织、细胞或染色体中DNA、RNA杂交，继而通过分析标记探针在被检对象中的显示状况而达到对特殊目标顺序进行检测、定位的目的。
  • 6.3致突变试验中的问题
    • 阴性、阳性对照的设立： 阴性对照：即未处理对照或溶剂对照 阳性对照：用某种已知能产生阳性反应的物 质作对照
    • 体外试验活化系统的采用： 许多化合物不具有致突变性，经哺乳动物代谢才转变成致突变物。由于微生物和培养的哺乳动物细胞缺乏整体动物体内的许多代谢能力。必须加入代谢活化系统以检出前致突变物。
    • 质量控制： 盲法观察/阴性对照和阳性对照的设立/资料的统计学分析/试验结果的重现性
    • 结果判定条件： ①最高剂量应包括受试物溶解度许可或灌胃量许可的最大剂量 ②各剂量的组间差距不应过大，以防漏检仅在非常狭窄范国内才有突变能力的某些外源化学物 阳性结果应当具有剂量-反应关系，即剂量越高，致突变效果越大，并在一组或多组的观察值与阴性对照之间有显著差异