第五版细胞生物学——细胞生物学研究方法

第五版细胞生物学——细胞生物学研究方法的思维导图，内容有细胞形态结构的观察方法、细胞及其组分的分析方法、细胞培养与细胞工程、细胞及生物大分子的动态变化、模式生物与功能基因组的研究。

细胞生物学研究方法

• 细胞形态结构的观察方法
  • 显微镜类型
    • 光学显微镜
      • 普通复式光学显微镜
        • 结构
          • 光学放大系统
            • 目镜
            • 物镜
          • 照明系统
            • 普通光源
            • 聚光镜
            • 滤光片
          • 镜架及样品调节系统
        • 原理
          • 经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像
        • 观察对象
          • 直接观察
            • 单细胞生物
            • 体外培养细胞
          • 间接观察
            • 生物组织样品
              • 处理过程
                • 1.取材
                • 2.固定
                  • 固定剂为甲醛
                • 3.包埋
                  • 包埋剂如石灰
                • 4.切片
                • 5.染色
                  • 苏木精和伊红染色（又称H-E染色）
                  • 原理
                    • 碱性染料苏木精和酸性染料伊红分别与细胞核和细胞质的某些成分特异性结合，从而改变透射光线的波长。因此可以看到蓝紫色的细胞核和红色的细胞质的形态。
      • 相差显微镜
        • 结构
          • 光学放大系统
            • 目镜
            • 物镜
          • 照明系统
            • 普通光源
            • 聚光镜
            • 滤光片
          • 镜架及样品调节系统
          • 环状光阑
          • 相差板
          • 作用
            • 可将这种光程差或相位差，通过光的干涉作用，转换成振幅差，因此，可以分辨出细胞中密度不同的各个区域。
        • 原理
          • 当两束光通过光学系统时，会发生相互干涉。如果它们的相位相同，干涉的结果是使光的振幅加大，亮度增强。反之，就会相互抵消而亮度变暗
      • 微分干涉显微镜
        • 结构
          • 光学放大系统
            • 目镜
            • 物镜
          • 照明系统
            • 平面偏正光为光源
              • 样品更加立体
            • 聚光镜
            • 滤光片
          • 镜架及样品调节系统
          • 环状光阑
          • 相差板
          • 作用
            • 可将这种光程差或相位差，通过光的干涉作用，转换成振幅差，因此，可以分辨出细胞中密度不同的各个区域。
        • 原理
          • 当两束光通过光学系统时，会发生相互干涉。如果它们的相位相同，干涉的结果是使光的振幅加大，亮度增强。反之，就会相互抵消而亮度变暗
      • 倒置显微镜
        • 结构
          • 光学放大系统
            • 目镜
            • 物镜
              • 物镜与照明系统颠倒。 工作距离长，可观察较远物体中的样品
          • 照明系统
            • 平面偏正光为光源
              • 样品更加立体
            • 聚光镜
            • 滤光片
          • 镜架及样品调节系统
          • 环状光阑
          • 相差板
          • 作用
            • 可将这种光程差或相位差，通过光的干涉作用，转换成振幅差，因此，可以分辨出细胞中密度不同的各个区域。
      • 荧光显微镜
        • 结构
          • 光学放大系统
            • 目镜
            • 物镜
          • 照明系统
            • 紫外线光源
              • 波长短，分辨力＞普通显微镜
            • 聚光镜
            • 2个特殊的滤光片
            • 照明方式为落射式
          • 镜架及样品调节系统
        • 基本原理
        • 样品处理
          • 1.样品作为抗原
          • 2.抗体结合
          • 3.带荧光的抗体的抗体结合
          • 不直接用带荧光抗体原因
            • 若直接用带荧光的抗体，则荧光量少，不易见
      • 超高分辨率显微术
        • 全内反射荧光显微术
          • 观察对象
            • 对单分子的动态观测
        • 基于单分子成像技术的PALM/STORM方法
          • 基本原理
            • 光激活定位显微术照射单分子
    • 电子显微镜
      • 结构
        • 电子束照明系统
          • 电子枪
          • 聚光镜
        • 成像系统
          • 物镜
          • 中间镜
          • 投影镜
        • 真空系统
          • 用两级真空泵不断抽气，保持电子枪、镜筒及记录系统内的高度真空，以利于电子的运动
        • 记录系统
          • 电子成像须通过荧光屏显示用于观察或用感光胶片或CCD相机记录下来。
      • 电镜制样技术
        • 超薄切片技术
          • 过程
            • 1.固定
              • 方法
                • 化学固定剂
                  • 四氧化锇
                  • 戊二醛
                • 物理方法
                  • 超低温冷冻
              • 注意
                • 1.固定操作中，动物的处死和取材都要快速进行，防止细胞自溶作用造成的损伤
                • 2.固定的样品快直径一般小于1mm，以便固定剂迅速渗透
            • 2.包埋
              • 目的
                • 保证在切片过程中，包埋介质能均匀良好地支撑样品，以便获得连续、完整并有足够强度的超薄切片。
              • 介质要求
                • 1.具有良好的机械性能（如刚度和韧性等）以利于切片 2.在聚合过程中，不发生明显的膨胀与收缩 3.观察样品时，易被电子穿透并能耐受的电子轰击 4.在高倍放大的图像中不显示本身结构等特征
              • 包埋剂
                • 各种环氧树脂
              • 注意
                • 生物样品固定后含有大量水分，而包埋剂多具疏水性质。因此固定的样品在包埋前通常要经过一系列的脱水处理
            • 3.切片
              • 厚度
                • 40~50nm
              • 工具
                • 以玻璃或钻石为材料的切片刀
            • 4.染色
              • 染色剂
                • 重金属盐。 锇酸——脂质 柠檬酸—蛋白质 乙酸双氧铀—核酸
          • 作用
            • 1.观察各种细胞的超微结构 2.在超微结构水平上完成蛋白质与核酸等组分的定性、定位和半定量研究。
          • 观察效果
            • 黑白 当电子束穿过样品时，样品中的金属离子不同程度地散射和吸收电子，在样品的图像上形成明暗差别。因此，电镜下观察到的图像只能为黑白图像
        • 负染色技术
          • 过程
            • 1.用重金属盐对铺展在载网上的样品进行染色。 2.吸去多余染料，样品自然干燥后，整个载网上都铺上了一薄层重金属盐，从而衬托出样品的精细结构。
          • 染色剂
            • 重金属盐，如：磷钨酸或醋酸双氧铀
          • 作用
            • 显示物体轮廓
        • 冷冻蚀刻技术
          • 过程
            • 1.冰冻断裂
              • 用快速低温冷冻法，在液氮或液氦中将样品迅速冷却，然后低温下进行断裂。
              • 作用
                • 冷冻样品往往从其结构相对“脆弱”的部位（即膜脂双分子层的疏水端）裂开，从而显示出镶嵌在膜脂中的蛋白质颗粒。
            • 2.蚀刻复型
              • 1.经过一段时间冰的升华（又称蚀刻），进一步增强图像“浮雕”样的效果。 2.再用铂等重金属进行倾斜喷镀，以形成对应与凹凸断裂面的电子反差。 3.用碳进行垂直喷镀，在断裂面上形成一层连续的碳膜。 4.用消化液把生物样品消化掉，将复型膜（碳膜及其被碳膜包裹的，含有图像信息的金属微粒膜）移到在载网上，电镜下观察。
          • 作用
            • 观察膜断裂面上的蛋白质颗粒和膜表面形貌特征
        • 低温电镜技术
          • 过程
            • 不经过固定、包埋、染色和干燥等步骤 将样品直接在冷冻剂中快速冷冻，形成100~300nm厚的冰膜，在电镜内-160℃低温下利用相位衬度成像。
          • 作用
            • 研究生物大分子的三维结构，即对包被在冰膜中相同的、分散的、取向随机性的大量颗粒性样品进行拍照和三维重构处理。
    • 扫描隧道显微镜
      • 原理
        • 隧道效应
          • 通常在低电压下，二电极之间具有很大的阻抗，阻止电流通过，称之为势垒；当二电极之间近到一定距离（50nm以内）时，电极之间产生电流，称隧道电流。这种现象称隧道效应。 并且隧道电流和针尖与样品之间的间距呈指数关系，这样间距可转化为电流的函数而被测定，针尖的位置就可以确定，因此样品的表面形貌就可以确定。
      • 装置
        • 实现X,Y,Z三个方向扫描的压电陶瓷
        • 逼近装置
        • 电子学反馈控制系统
        • 数据采集、处理、显示系统
      • 特点
        • 1.具有原子尺度的高分辨本领，侧分辨率为0.1~0.2nm，纵分辨率可达0.001nm
        • 2.可以在真空、大气、液体（接近于生理环境的离子强度）等多种条件下工作
        • 3.非破坏性测量，因为扫描时不能接触样品，又没有高能电子束轰击，基本上可避免样品的形变。
      • 作用
        • 直接观察到DNA、RNA和蛋白质等生物大分子及生物膜、病毒等结构
  • 光学显微镜与电子显微镜的区别
    • 
  • 显微镜性能参数
    • 分辨率D
      • 是指能区分两个质点间的最小距离
      • 影响因素
        • 光源波长λ
        • 物镜进口角α
          • 标本在光轴上的一点对物镜镜口的张口
        • 介质折射率N
        • 镜口率NA=N*sin(α/2)
      • 关系式
      • 分辨率越高，分辨能力越低
• 细胞及其组分的分析方法
  • 超离心技术分离细胞组分
    • 方法
      • 密度梯度离心
        • 类别
          • 速度沉降
            • 作用
              • 用于分离密度相近而大小不一的细胞组分
            • 过程
              • 离心前，将要分离的细胞匀浆放置在蔗糖溶液梯度（通常质量分数范围为5%—40%）溶液的上层，各种细胞组分根据它们的大小以不同的速度沉降，形成不同的沉降带，然后分别收集不同的沉降带中的组分，用于分析
          • 等密度沉降
            • 作用
              • 分离不同密度的细胞组分
            • 过程
              • 细胞组分在连续梯度的高密度介质中经离心力场长时间的作用沉降或漂浮到与自身密度相等的位置，形成不同的密度区带。
        • 介质
          • 蔗糖和氯化铯
        • 原理
          • 将要分离的细胞组分小心地铺放在含有密度逐渐增加的，高溶解性的惰性物质（如蔗糖）形成的密度梯度溶液表面，通过重力或者离心力的作用，使样品中不同组分以不同的沉降率沉降，形成不同的沉降带。
        • 注意
          • 各组分的沉降率与它们的形状和大小有关，通常以沉降系数(S值)表示。
      • 差速离心
        • 原理
          • 低速与高速离心交替进行，使各种沉降系数不同的颗粒先后沉淀下来，达到分离的目的。
    • 密度梯度离心和差速离心的区别
      • 1.定义不同
        • 差速离心：采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。起始的离心速度较低，让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍然悬浮在上清液中。收集沉淀，改用较高的离心速度离心悬浮液，将较小的颗粒沉降，以此类推，达到分离不同大小颗粒的目的。
        • 密度梯度离心：用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。
      • 2.原理不同
        • 差速离心：物体围绕中心轴旋转时会受到离心力F的作用
        • 密度梯度离心：不同颗粒之间存在沉降系数差，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带
      • 3.转速不同
        • 差速离心：用多个离心转速
        • 密度梯度离心：只用一个离心转速
      • 4.密度不同
        • 差速离心：样品中各沉降系数差别较大的组分
        • 密度梯度离心：样品密度有一定的差异
  • 特异蛋白抗原的定位与定性
    • 免疫荧光技术
      • 直接免疫荧光技术
      • 间接免疫荧光技术
      • 实验步骤
        • 荧光抗体的制备
        • 标本的处理
        • 免疫染色
        • 观察记录
      • 宗旨
        • 尽量完好地保持被检测蛋白质的抗原性
    • 免疫电镜技术
      • 实验步骤
        • 样品的固定
        • 包埋
        • 超薄切片制备
        • 免疫标记
        • 染色
      • 关键
        • 既要保持样品中蛋白的抗原性，又要尽量保存样品的精细结构。
  • 细胞内特异核酸的定位与定性
    • 原位杂交技术
      • 概念
        • 原位杂交是指，用标记的核酸探针通过分子杂交研究特异 核苷酸序列在染色体上或在细胞中位置与分布的方法。
      • 分类
        • 光镜水平
          • 放射性同位素标记探针——显微放射自显影
          • 同位素或荧光素标记探针——荧光显微镜
        • 电镜水平
          • 生物素-抗生物素抗体相连的胶体金颗粒——电子显微镜
  • 细胞成分的分析与细胞分选技术
    • 流式细胞术
      • 作用
        • 1.定量地测定某一细胞中的DNA,RNA或某一特异的标记蛋白的含量， 以及细胞群体中上述成分含量不同的细胞的数量
        • 2.可将某一特异染色的细胞从数以万计的细胞群体中分离出来
        • 3.将DNA含量不同的中期染色体分离出来
        • 4.细胞的分选
• 细胞培养与细胞工程
  • 细胞培养
    • 动物细胞培养
      • 细胞分类
        • 按培养代数
          • 原代细胞
            • 从机体取出后立即培养的细胞。
          • 传代细胞
            • 进行传代培养后的细胞。
        • 按培养代数是否有限
          • 有限细胞系
            • 传代次数有限（一般40~50代）的体外培养细胞
          • 永生/连续细胞系
            • 细胞发生遗传突变，并使其带有癌细胞的特点，能无限制地传代培养下去。
            • 特点
              • 1.染色体明显改变
              • 2.染色体一般呈亚二倍体或非整倍体
              • 3.失去接触抑制
              • 4.容易传代培养
        • 按细胞的形态
          • 成纤维样细胞
          • 上皮样细胞
          • 可移动的游走细胞
        • 细胞株
          • 具有特殊的遗传标记或性质，这样的细胞系可以称为细胞株
      • 培养类型
        • 原代培养
          • 传至10代以内的细胞统称为原代细胞培养
        • 传代培养
          • 10代细胞之后称为传代培养
      • 培养步骤
        • 1.取出健康动物的组织块，剪碎，用浓度与活性适中的胰酶或胶原酶与EDTA（螯合剂）等将细胞连接处消化使其分散
        • 2.给与良好的营养液+无菌培养环境+小牛（或胎牛）血清
        • 3.静置培养或慢速转动培养
      • 注意
        • 1.转移时1：2（1个培养基里的细胞量最多转移给2个或3个培养基）
        • 2.接触面小有贴壁现象，启动生长、分裂信号
    • 植物细胞培养
      • 类型
        • 细胞培养（单倍体细胞培养）
          • 用花药在人工培养基上进行培养。从小孢子（雄性生殖细胞）直接发育成胚状体，然后长成单倍体植株
        • 原生质体培养
          • 用植物体细胞（二倍体细胞），先经纤维素酶处理去掉细胞壁。去壁的细胞称为原生质体
        • 植物组织培养
          • 分离出小块的植物体，又称外植体，在体外无菌条件下进行培养，形成愈伤组织，即植物创面的新生组织。在一定条件下，诱导分化最终长成植株。
  • 细胞工程
    • 细胞融合
      • 促融剂
        • 灭活的病毒（如仙台病毒）
        • 化学物质（如聚乙二醇，PEG）
        • 高压脉冲
    • 单克隆抗体技术
      • 单克隆抗体的制备原理
        • 小鼠的骨髓瘤细胞与脾B淋巴细胞在聚乙二醇或灭活的病毒的介导下发生融合。融合后的杂交瘤细胞，具有两种亲本细胞的特性可以分泌抗体和无限增殖。 骨髓瘤细胞不能在含有氨基蝶呤的HAT培养液中通过旁路合成核酸而得以生存。所以通过HAT培养基选择培养和细胞克隆，可以获得大量分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
      • 优点
        • 可以利用混合型的异质抗原制备出针对某一单一性抗原分子特异决定族的同质性单克隆抗体。
    • 显微操作技术与动物的克隆
      • 技术
        • 细胞拆合
          • 把细胞核与细胞质分离开来，然后把不同来源的胞质体和核质体相互组合，形成核质杂交细胞
          • 物理法
            • 用机械方法或短波光把细胞核去掉或使之失活，然后用微细管吸取其他细胞核，注入去核的细胞质中，组成新的杂交细胞。这种核移植必须用显微操纵仪进行操作。
          • 化学法
            • 用细胞松弛素B处理细胞，细胞出现排核现象，再结合离心技术，将细胞拆分为核质体核胞质体两部分。在PEG或灭活病毒的介导下，与其他的胞质体或核质体融合。
• 细胞及生物大分子的动态变化
  • 荧光漂白恢复技术
    • 作用
      • 1.检测所标记分子在活体细胞表面或细胞内部的运动
      • 2.检测所标记分子咋活体细胞表面或细胞内部的迁移速率
    • 原理
      • 1.利用高能激光束照射细胞的某一特定区域，使该区域内标记的荧光分子发生不可逆的淬灭，这一区域称光漂白区。
      • 2.由于细胞中脂质分子或蛋白质分子的运动，周围非漂白区的荧光分子不断向光漂白区迁移。结果使光漂白区的荧光强度逐渐地恢复到原有水平。这一过程称荧光恢复
      • 3.荧光恢复地速度在很大程度上反映荧光标记的脂质或蛋白质在细胞中的运动速率
  • 酵母双杂交技术
    • 原理
      • 细胞基因转录起始需要转录激活因子的参与，转录激活因子一般由两个或两个以上相互独立的结构域构成： 1.DNA结合域 可识别DNA上的特异转录调控序列并与之结合 2.转录激活域 可与其他成分作用形成转录复合体，从而启动它所调节的基因的转录
  • 荧光共振能量转移技术
    • 原理
      • 在一定波长的激发光照射下，只有携带发光基因A的供体分子可被激发出荧光A，而同一激发光不能激发携带发光基因B的受体分子发出荧光B。 然而，当供体所发出的荧光光谱A与受体上的发光基因之间的距离小到一定程度时，就会发生不同程度的能量转移现象，即以供体的激发波长A激发时，可观察到受体发射的荧光B，这种现象称为FRET。 在体内，如果两个蛋白质分子的距离在10nm之内，就可能发生FRET现象，由此认为这两个蛋白质存在着直接的相互作用。
  • 双分子荧光互补分析技术
  • 作用
    • 判断分子之间有无特异性结合关系
  • 放射自显影技术
    • 作用
      • 放射性标记细胞内生物大分子，进行定性、定位与半定量研究。对细胞或生物体内生物大分子进行动态研究和追踪。
    • 步骤
      • 1.用合适的放射性前体分子标记机体或细胞， 按实验需要与标记的持续时间，分为持续标记和脉冲标记
      • 2.标记后的组织与细胞可按常规方法制片
      • 3.在暗室中向样品表面均匀地敷一层厚3~10μm地乳胶膜
      • 4.在暗盒中曝光（或称自显影）数天，再经显影、定影后于显微镜下观察
• 模式生物与功能基因组的研究
  • 模式生物特点
    • 1.个体小
    • 2.易培养
    • 3.操作简单
    • 4.生长繁殖快
  • 常用模式生物
    • 大肠杆菌——原核生物代表
      • 特点
        • 1.培养方便
        • 2.生长快
        • 3.基因结构简单
        • 4.突变体诱变，分离和鉴定容易
        • 5.转基因技术成熟
        • 6.进行基因定位简便易行
    • 酵母——单细胞真核生物代表
      • 特点
        • 1.生殖方式有芽殖和裂殖
        • 2.有各种细胞器和细胞和
        • 3.生长迅速
        • 4.易于遗传操作
      • 作用
        • 1.为揭示细胞周期调控的分子打下基础
        • 2.酵母基因突变体库也为蛋白质相互作用、基因表达调控、细胞分化和衰老等领域提供 了重要的研究材料。
    • 线虫
      • 特点
        • 1.繁殖快
        • 2.生命周期仅为3天
        • 3.在显微镜下通体透明，可以追踪体内每一个细胞的形成
        • 4.胚胎发育过程中，细胞分裂，分化以及细胞的死亡具有高度的程序性，便于对其进行遗传学分析
    • 果蝇
      • 特点
        • 1.具有丰富的表性特征，易于进行遗传学操作
    • 斑马鱼
      • 特点
        • 1.有许多基因与人类的基因存在一一对应的关系
        • 2.容易饲养，一般孵化3个月后，可达到性成熟，每次产卵200个左右
    • 小鼠
      • 特点
        • 1.小鼠在进化和基因组方面和人类接近
        • 2.可建立人类疾病的小鼠模型
    • 拟南芥
      • 特点
        • 1.个体小，30cm
        • 2.生长周期快
        • 3.种子多
        • 4.生活力强，用普通培养基可做人工培养
        • 5.具有最小的植物基因组，自花授粉容易获得各种突变种