导图社区 Hepatic soluble epoxide hydrol
- 31
- 0
- 0
- 举报
Hepatic soluble epoxide hydrol
Hepatic soluble epoxide hydrolase activity regulates cerebral Ab metabolism and the pathogenesis of Alzheimer’s disease in mice 肝可溶性环氧化物水解酶活性调节小鼠脑Ab代谢和阿尔茨海默病的发病机制
编辑于2023-08-26 21:16:08 云南- 相似推荐
- 大纲
Hepatic soluble epoxide hydrolase activity regulates cerebral Ab metabolism and the pathogenesis of Alzheimer’s disease in mice 肝可溶性环氧化物水解酶活性调节小鼠脑Ab代谢和阿尔茨海默病的发病机制
摘要
阿尔茨海默病(AD)是由遗传和环境因素之间复杂的相互作用引起的。然而，外周器官在衰老过程中对环境刺激的反应变化在AD发病机制中的作用仍然未知。肝脏可溶性环氧化物水解酶(sEH)的活性随着年龄的增长而增加。肝sEH操作双向减轻AD小鼠模型的脑淀粉样蛋白b (Ab)负荷、tau病变和认知缺陷。此外，肝脏sEH操作双向调节14，15-环氧二十碳三烯酸(-EET)的血浆水平，其快速穿过血脑屏障并通过多种途径调节脑Ab代谢。大脑中14，15-EET和Ab水平之间的平衡对于防止Ab沉积至关重要。在AD模型中，14，15-EET输注在生物学和行为学水平上模拟了肝sEH消融的神经保护作用。这些结果强调了肝脏在AD病理学中的关键作用，并且靶向肝脑轴以响应环境刺激可能构成用于AD预防的有前途的治疗方法
介绍
定义
阿尔茨海默病(AD)是痴呆的主要原因，其特征在于脑中淀粉样蛋白-b (Ab)斑块的病理性积聚、由磷酸化tau组成的神经原纤维缠结以及以进行性认知障碍和痴呆为标志的神经变性。
选题依据
尽管在了解AD病理生理学方面取得了进展，但仍然需要在明显的临床症状出现之前识别AD病理的基于血液的生物标志物以及更有效的治疗
论据1
“Ab级联假说”一直被认为是AD发病机制的核心。AD是由遗传和环境因素之间的复杂相互作用引起的。大脑和外周器官在衰老过程中都会发生病理生理变化。
越来越多的证据表明，外周组织中的基因调节与大脑功能和行为有关，如学习和记忆、社交和认知、焦虑、抑郁和大脑自身免疫调节。
外周器官参与大脑Ab沉积和清除，且外周载脂蛋白E (ApoE， 由APOE编码)同种型对大脑功能和AD发病机理的贡献不同。
关于受环境刺激影响的外周器官年龄相关变化如何影响大脑Ab代谢的知识有限。 在这个方向上的更多研究可以让我们开发出具有临床转化潜力和AD初级预防的基于血液的生物标志物。
论据2
我们关注最大的外周器官肝脏，因为衰老与肝脏的形态功能变化有关。AD是一种代谢性疾病，肝脏是机体的中枢代谢器官。
与年龄相关的肝质量和血流量的下降会影响肝脏的代谢功能。 热量限制可以延长寿命并影响肝脏代谢途径。
阿尔茨海默病患者的肝功能障碍明显大于健康个体。 肝脏是花生四烯酸(AA)的主要来源，最近的小家鼠寿命单细胞转录图谱显示肝脏中与年龄相关的AA代谢功能障碍。 可溶性环氧化物水解酶(sEH，由EPHX2编码)是二十碳四烯酸生物学中的关键酶 包括环氧二十碳三烯酸(EETs)，尤其是14，15-EET，它们通过环氧酶代谢途径从AA中获得。
以前的研究表明，EPHX2基因位于PTK2BCLU基因座，这是与AD全基因组连锁的有力证据。 随着其他研究，我们发现Ephx2缺失或sEH的药物抑制缓解了AD小鼠模型中的AD发病机制。 最后， 抑郁症是AD的独立危险因素，肝脏sEH在抑郁症的病理生理学中起着关键作用。
然而，肝脏在衰老中的作用以及肝脏对环境刺激的反应如何导致AD的发病机制仍不清楚。
论证
在这项研究中，在AD小鼠模型中使用遗传学方法，包括五个家族性AD (53FAD)突变转基因小鼠和三转基因AD (33TgAD)小鼠，我们发现肝脏sEH活性调节14，15-EET的血浆水平，其快速穿过血脑屏障(BBB)并调节大脑Ab代谢。
研究结果
我们的结果表明，肝脏在AD的发病机制中起着关键作用，针对肝脑轴对环境刺激的反应可能是预防AD的一种有前途的治疗方法。
主题
方法
实验对象
老鼠
53FAD、33TgAD、Myh6-CreERT2、Fgfr3-iCreERT2、Sftpc-CreERT2和Rosa26-LSL-tdTomato小鼠购自Jackson实验室。 Ephx2loxp/loxp, Ephx2-CreERT2和Alb-CreERT2小鼠在我们之前的研究中进行了描述，并从上海模式生物中心公司获得。所有小鼠回交到C57BL/6J背景。
Alb-CreERT2小鼠×Ephx2loxp/loxp小鼠＝Alb-CreERT2；Ephx2loxp/+小鼠 × Ephx2loxp/loxp小鼠杂交＝Alb-CreERT2;Ephx2loxp/loxp小鼠 Myh6-CreERT2;Ephx2loxp/loxp小鼠、Fgfr3-iCreERT2;Ephx2loxp/loxp小鼠、Fgfr3-iCreERT2小鼠、Sftpc-CreERT2小鼠×Ephx2loxp/loxp小鼠＝Myh6-CreERT2;Ephx2loxp/loxp小鼠。 Ephx2loxp/loxp小鼠×53FAD小鼠/33TgAD小鼠＝53FAD::Ephx2loxp/loxp小鼠/33TgAD::Ephx2loxp/loxp小鼠。 Alb-CreERT2、Ephx2loxp/loxp小鼠×53FAD、Ephx2loxp/loxp小鼠＝53FAD::Alb-CreERT2;Ephx2loxp/loxp小鼠。 我们也用这种方法生成了33TgAD::Alb-CreERT2;Ephx2loxp/loxp小鼠。性别匹配的没有Alb-CreERT2的幼崽作为对照。将终浓度为10 mg/mL的他莫昔芬(TAM)溶解于玉米油中，每天腹腔注射1次(100 mg/kg)，连续5天，用Cre重组切除loxp部位。 Ephx2CreERT2、Rosa26-LSL-tdTomato小鼠×Ephx2-CreERT2小鼠杂交＝Rosa26-LSL-tdTomato小鼠。
C57BL/6J小鼠来源于北京维特河实验动物科技有限公司(北京)。采用聚合酶链反应(PCR)鉴定转基因小鼠，琼脂糖凝胶电泳鉴定转基因小鼠。
食蟹猴
食蟹猴选自三个不同的年龄组，包括老年组(15至17岁)、中年组(7至12岁)和青年组(1至3岁)。为了尽量减少伦理问题，每只猴子只采集一次血液。收集总共2 mL血液用于血浆EET测量。表S1提供了猴子体内eet的血浆水平。
人类实验对象
所有血液样品均从南方医院。根据NIA-AA疑似AD痴呆的诊断标准确定疑似AD的临床诊断。60名对照组受试者年龄超过50岁，无认知障碍(NCI)，能够配合完成认知评估，既往无认知功能障碍病史，无精神障碍史，无重要器官功能障碍。收集AD患者和NCI受试者的血样用于EET测量。S4表中列出了受试者的性别、年龄和血浆EETs结果
分子检测
组织制备
小鼠麻醉后灌注0.9%生理盐水。采集脑、肝、心及其他外周器官和组织。立即冷冻一个脑半球进行生化分析，另一个脑半球固定在4%多聚甲醛中进行组织学观察。大约20毫克新鲜外周器官和组织立即测试可溶性环氧化物水解酶(sEH)的活性。剩余的组织或器官要么固定在4%的多聚甲醛中，要么在-80 ℃冷冻以作进一步分小鼠麻醉后灌注0.9%生理盐水。采集脑、肝、心及其他外周器官和组织。立即冷冻一个脑半球进行生化分析，另一个脑半球固定在4%多聚甲醛中进行组织学观察。大约20毫克新鲜外周器官和组织立即测试可溶性环氧化物水解酶(sEH)的活性。剩余的组织或器官要么固定在4%的多聚甲醛中，要么在-80 ℃冷冻以作进一步分析。
sEH活性测定
外周器官和组织在冰冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中均质。然后样品在4℃下9000 g离心15分钟。收集上清液并使用BCA蛋白检测试剂盒(Thermo Fisher Scientific)进行定量。已知不同的器官在不同水平上表达sEH肝、心、肾、脾、肺的定量上清液分别用PBS按1:45 00、1:10 00、1:3 00、1:20 00、1:50的比例稀释。然后，底物(10 mL的14,15eet;10 mg/mL)组成200 mL的反应体系，在37 ℃下孵育60 min。加入10 mL的sEH抑制剂，1-三氟甲氧基苯基-3-(1-丙基哌啶-4-基)尿素(TPPU)终止反应;800海里)。为了检测14,15-二氢内酯，加入等量的含有20 ng/mL 14,15- eet -d11的甲醇作为内标。14000 rpm离心10 min后，用上清液测定eet和DHETs的相对浓度。在我们的实验条件下，反应产物14,15- dhet的生成随着sEH活性的增加而增加。每个样品的sEH活性是用产生的14,15- dhet的量来计算的，并以控制值的百分比表示。
测量的特点
采用超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS /MS)分析测定血浆和脑组织样品中EETs和DHETs的水平，如我们之前的报告所述简单地说，麻醉下抽取眼球血获得小鼠抗凝全血，离心(4500转/分，10分钟)，收集血浆200 mL。随后，将t-TUCB (800 nM)，一种sEH抑制剂加入血浆中。脑组织迅速称重并在0.1 M含TPPU (10 mM)的PBS中均质。血浆或脑组织悬浮液(200 mL)与甲醇(200 mL)混合，甲醇中含有20 ng/mL的11,12- eet -d11和11,12- dht -d11作为内标。混合物在4℃下以4500 rpm旋转10 min，在4℃下以6000 rpm离心1 min。样品在80℃下沉淀蛋白质2 h，在4℃下以14000 rpm离心10 min，过滤收集上清用于UPLC-MS /MS分析。UPLC-MS /MS系统由TurboFlow模式的Prelude高效液相色谱系统和TSQ Quantiva (Thermo Fisher Scientific)组成。对于样品提取和色谱分离，TurboFlow- lc系统配备TurboFlow Cyclone P柱(0.5 3 50 mm, Thermo Fisher Scientific)，在Acquity UPLC BEH C18柱(2.1 3 100 mm, 1.7 mm, Waters)上进行反相分离。制备了hplc级纯蒸馏水(屈臣氏)、乙腈、甲醇和2-丙醇(默克)和乙酸(赛默飞世尔科学)。流动相为(1)0.02%醋酸水溶液，(2)乙腈，(3)乙腈/2-丙醇(50:50,v/v)。将每种样品的20 mL等分液注入柱中。自动进样器保持在4℃，色谱柱保持在40℃。5,6- eet的监测离子为m/z 319 / 191, 8,9- eet为319 / 123,11,12eet为319 / 167,14,15- eet为319 / 219,5,6- dhet为337 / 145,8,9- dhet为337 / 127,11,12- dhet为337 / 167,14,15- dhet为337 / 207,11,12- eet -d11为330 / 312,11,12- d11为348 / 167,14,15- eet -d11为m/z 330 / 312。使用TraceFinder 4.1通用LC软件(Thermo Fisher Scientific)获取数据并进行分析。
评估14,15- eet通过血脑屏障的能力
用氘标记的14,15- eet (14,15- eet -d11)作为示踪剂评估14,15- eet穿过血脑屏障(BBB)的能力。如前所述，进行颈动脉插管2月龄雄性小鼠(体重20 ~ 25 g)连续3天灌胃TPPU (ig, 10 mg/kg)62(简称TPPU组)。最后一次注射TPPU后30min用异氟醚麻醉小鼠。作为对照动物，小鼠未接受TPPU治疗(称为无TPPU组)。在体视显微镜(Nikon, SMZ745T)下，经颈部正中切口暴露右侧颈总动脉，分离结扎颈外动脉，仔细解剖颈内动脉，结扎翼腭动脉。接下来，0.2 mm直径的导管(RWD生命科学，深圳，中国)通过颈总动脉插入颈内动脉。14,15- eet -d11 (500 ng / 100 mL)通过导管以每秒4 mL的速度给药给鼠。分别于注射14、15EET-d11后1、2、5、10 min采集样品。取血样于含5 mM EDTA的管中，0.9%生理盐水心脏灌注2 min后提取脑组织，海马和纹状体组织保存于含TPPU (10 mM)的200 mL PBS溶液中，液氮冷冻。使用EET测量方案测量血浆和脑中的14,15-EET-d11和14,15- det -d11水平。题
免疫组织化学
按照我们之前的方案进行组织制备和免疫组化简单地说，小鼠用戊巴比妥(i.p, 80 mg/kg)深度麻醉，然后用0.1 M PBS灌注4%多聚甲醛。随后解剖脑和周围组织，并将其浸泡在30%蔗糖溶液中后固定。冷冻切片机(徕卡)切割组织切片(40 mm);然后在0.1 M PBS中洗涤335 min，然后在含有0.5% Triton X-100的10%山羊血清中在室温下阻断2 h，然后在含有一抗:小鼠抗6e10 (803001, biolgend, 1:10 00)的阻断液中在4C下染色24 h;兔抗gfap (AB5804, Millipore, 1:500);兔抗iba1 (019-19741, Wako, 1:500);兔抗tau蛋白(T22) (ABN454, Millipore, 1:20 00);绵羊抗trem2 (AF1729, r&d Systems, 1:20 00);pe抗小鼠CD68 (137013, biolgend, 1:50)。然后用PBS冲洗335分钟，用荧光素偶联二抗(Thermo Fisher Scientific)在室温下以1:500的稀释度孵育2小时。 用荧光显微镜(尼康)捕获共聚焦图像。使用NIH Image J软件定量测定Ab染色区域的面积分数、荧光信号和细胞数量。使用Imaris软件(Bitplane)进行三维绘制和分析。
硫黄素S染色
按照之前的报道进行硫黄素S (ThS)染色简单地说，经过30分钟的超纯水冲洗和三次5分钟的0.1 M PBS洗涤后，切片在0.01% ThS和50%乙醇中孵育8分钟，然后用50%乙醇洗涤三次，每次洗涤5分钟。荧光显微镜(Nikon)采集图像后，使用NIH Image J软件对th阳性斑块进行计数。
ELISA法测定淀粉样蛋白b
皮质和海马组织用2%十二烷基硫酸钠(SDS)和蛋白酶抑制剂均质。然后，匀浆在4℃下100000 g离心1 h。然后将含有可溶性Ab(即sds -可溶性Ab)的上清液吸入管中。含不溶性淀粉样蛋白b的微球，用70%甲酸(代表fa可提取Ab)提取。用1 M Tris磷酸盐缓冲液(pH 11.0)以1:20稀释FA提取物，达到初始中和。然后按照制造商的说明(Thermo Fisher Scientific)，使用固相三明治酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒测定Ab40和Ab42，进行Ab的定量测定。简而言之，将50 mL的Ab标准品(以形成浓度梯度)和蛋白质样品加入Ab抗体层析板，然后加入50 mL检测抗体。37℃孵育1小时后，弃液，洗孔4次，至少30秒。然后加入抗兔马萝卜过氧化物酶(HRP)工作液100 mL，室温孵育30 min，再加入稳定的显色剂100 mL，室温孵育30 min。然后，我们加入100 mL停止溶液，使用VICTORTMX3多标签读取器(PerkinElmer)在450 nm波长下读取每孔的吸光度。通过标准曲线拟合计算Ab40和Ab42的浓度。
蛋白质印迹法
组织或细胞球在基于洗涤剂的裂解缓冲液中裂解(50 mM Tris, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 1% Triton X-100, 1%脱氧胆酸钠，0.1% SDS和1 mM PMSF)。裂解液14000 g在4℃下离心20分钟，上清收集到管中。然后使用BCA法(Thermo Fisher Scientific)对上清液进行总蛋白浓度定量。蛋白样品在上样缓冲液中煮沸10分钟，然后用10%或15%的SDS-PAGE凝胶分离。然后将凝胶转移到PVDF膜(Millipore)上，用5%的牛奶在室温下阻断1小时。接下来，将膜与一抗在4℃下孵育过夜。将膜与合适的酶标二抗在室温下孵育1小时。最后，使用ECL试剂盒(Millipore)可视化信号。在本研究中，使用了各种抗体来检测这些特定蛋白质的水平。淀粉样蛋白β前体蛋白(APP)和Ab聚合物采用抗体6E10 (803001, Biolegend, 1:10 00)检测。采用β淀粉样蛋白前体蛋白抗体(Y188) c端片段(ab32136, Abcam, 1:10 00)和n端APP抗体(A8967, Sigma-Aldrich, 1:20 00)分别检测全长APP (FL-APP)、A -或b-CTF和APP n端片段(APP- ntf)。用抗ApoE抗体(701241,Thermo Fisher Scientific, 1:10 00)检测ApoE。检测BACE1、ADAM10、TREM2特异性抗体(A11533、A10438、A10482, ABclonal, 1:10 00)。用抗Vti1a抗体(TA505795, OriGene, 1:10 00)检测Vti1a。用抗sEH抗体(13560,Cayman, 1:50 000)检测sEH，用抗GAPDH抗体(60004-1-Ig，稀释度1:10 000,Proteintech)检测GAPDH。为了进行分析，将同一凝胶上的蛋白质水平归一化为GAPDH。所有定量均使用AlphaEase FC软件(Alpha Innotech)进行
蛋白质交联
蛋白质交联试验用于测量sEH寡聚物水平，按照我们之前的描述。27,36简单地说，肝脏样品在冰冷的PBS中均质(0.1 M磷酸盐，0.15 M NaCl;pH值7.2)。为了确定蛋白质浓度，在4℃下，9000 rpm离心15分钟，然后收集蛋白质上清。等量的每种蛋白质样品用5mm磺胺- egs (Thermo Fisher Scientific, 21566)处理，在冰上交联。随后加入10 mM Tris结束交联反应。然后，将样品用10% SDS-PAGE凝胶分离，转移到PVDF膜上进行western blot。
自动毛细管电泳免疫分析
为了确定磷酸化tau蛋白的水平，我们使用了全自动和高灵敏度的检测方法，将毛细管电泳与传统的western blot免疫检测相结合，使用一抗和偶联二抗;该方法已在我们上一份报告中说明实验按照ProteinSimple协议(ProteinSimple)进行。简单地说，匀浆组织离心后，用BCA法定量上清蛋白浓度。从每个样品中取等量(1mg /mL)的蛋白质在取样缓冲液(ProteinSimple)中稀释，并与53Master (ProteinSimple)按4:1的比例混合。接下来，我们在95℃下进行蛋白质变性和还原5分钟。然后将处理过的蛋白质样品装在12至230 kda板(ProteinSimple)上，并按照制造商的说明在JESS仪器上运行。我们使用了几种一抗，包括Tau (Ser396)抗体(NB100-82243, Novus, 1:10 000)， phosphotau (Ser202/Thr205)抗体(AT8) (MN1020, Thermo Fisher Scientific, 1:50)和总Tau抗体(Tau-5) (AHB0042, Thermo Fisher Scientific, 1:50 000)。用抗兔或抗小鼠二抗检测化学发光。采集图像，利用JESS软件(ProteinSimple)测定化学发光峰面积。峰面积归一化为GAPDH (60004-1-Ig, Proteintech, 1:50 000)作为加载对照。
抗体聚集测定
低聚物Ab的制备方法如上所述简而言之，单体合成Ab42 (Bachem, 4014447)在六氟-2-丙醇(HFIP;Sigma-Aldrich, 105228)至1mm的浓度。在肽溶液在室温下培养2小时期间，进行了几次间歇涡旋。然后将透明溶液放入微离心管中，然后在通风柜中蒸发;然后在SpeedVac(埃彭多夫)的真空下干燥。肽膜在DMSO中稀释至5 mM浓度，超声10分钟。在冷无酚红的Ham 's F-12 (Procell)中重悬至终浓度为100 mM，肽溶液立即涡流30秒。这后,解决方案是孵化24小时的4 C。测试四个特点亚型Ab42聚合的影响,特点与单体的合成co-incubated Ab42和聚合4 C 24 h或添加到包含聚合Ab42井和孵化37 C 10分钟。缺钱的最终浓度为0,100和400毫米。样本然后分开15% SDS PAGE凝胶和聚合物使用anti-6E10抗体检测
硫黄素T荧光测定
65 .硫黄素T (ThT)荧光测定方法如上所述首先，在NaPi (50 mM磷酸钠，0.15 M NaCl, pH 7.4)中混合单体合成10 mM Ab40 (Bachem, 4014442)和20 mM ThT;然后，将100 mL的混合物加入96孔板中，用微孔板盖密封。在37℃搅拌5秒后，每10分钟记录一次荧光强度，激发/发射波长为420/485 nm (PerkinElmer, USA)。为了测试EET对Ab40聚集的影响，将四种EET亚型分别添加到Ab40聚集实验中，最终浓度分别为2.5、10和40 mM。
病毒的产生和注射
重组腺相关病毒(血清型2/8,rAAV2/8)-eYFP-Ephx2和对照病毒由BrainVTA Technology(武汉，中国)设计，如我们之前的报道简单地说，设计引物生成小鼠Ephx2 (NM_007940)的编码区:正向50 -GCATGGACGAGCTGTACAAGGGAAGCGGAGCTACTAACTT-30，反向50 -GTTGATTATCTCGA GAATTCTCAGATCTTGGATGTCACGC-30，然后插入到rAAV2/8-Ef1a-eYFP载体中。shrna是通过一个发夹环连接含有正义和反义序列的寡核苷酸，然后是一个poly(T)终止信号来构建的。raav2 /8- egfp - ephx2 shRNA和混乱的控制shRNA之前已经被描述过。1,36靶向Ephx2的shRNA序列分别为50 -GCAGCTGATTGGAGAGTAA-30和50 - gagccaatctacctgagaat -30。以打乱序列TTCTCCGAACGTGTCACGT作为对照shRNA。随后，每只实验小鼠经尾静脉注射rAAV2/8病毒溶液200 mL(含1.0 3 1011 vg)。
行为检测
Y迷宫测试
工作记忆采用y形迷宫测试。有三个相同的30 3 10 3 20厘米的手臂和一个三角形连接中心区域到10 3 10 3 10厘米的手臂。每条手臂与另外两条手臂形成120的角度。老鼠被放置在一只手臂的末端，允许它们在迷宫中自由移动5分钟。老鼠选择进入手臂的顺序被记录下来。连续三次选择不同手臂的交替得分为一分。用手臂的总次数减去2，计算出交替的总次数。正确率=(总换发点数/总换发机会)3 100。在两次试验之间，75%的乙醇被用来清洁y形迷宫。
莫里斯水迷宫试验
水迷宫由一个装有不透明水(21±1℃)的圆形水箱组成。迷宫实际上分为四个象限，一个隐藏的平台(直径10厘米)淹没在水面以下1厘米处。老鼠被训练去寻找平台，通过另外三个不对称的迷宫线索作为空间参考来定位。在习得过程中，动物被以一种准随机的方式放入水中，以防止策略学习。老鼠被允许搜索平台90秒;如果老鼠不能在90秒内识别出平台，它们将被轻轻地引导到平台上，并在那里停留30秒，然后开始下一次试验。在完成四次试验后，老鼠被晒干并放回它们的家笼子里。老鼠每天训练四次，连续六天。逃逸潜伏期测量为动物在目标象限(Q1)找到隐藏平台所花费的时间。在最后一次训练(第7天)24小时后进行空间探针试验，移除平台，让小鼠游泳90秒。放置位置在第三象限和第四象限之间的边界，鼠标在开始时面向墙壁。数据以在象限Q1中花费的时间百分比、穿过平台的次数和游泳速度给出。当天下午，进行了视觉提示测试，在每次测试中，平台被标记为新的起点和目标位置。游泳行为由松下WVBP334摄像机拍摄，视频信号使用EthoVision XT 11.5 (Noldus)软件进行分析。
新型目标识别测试
新对象识别(NOR)测试是一种常用的行为测试，用于研究小鼠在各种环境下的学习和记忆NOR测试有三个阶段:习惯化、学习和测试。在习惯阶段，将小鼠置于宽40 cm的盒子中;深度40厘米，高度35厘米)放置5分钟以适应。在学习过程中，小鼠探索两个相同的物体(0)，每观察5分钟记录探索每个物体所花费的时间。在测试日，在测试日引入新的训练对象(N个)代替旧的训练对象;与之前一样进行分析。在每只实验小鼠之间，用75%乙醇彻底清洁仪器。探索被定义为在距离物体2至3厘米的范围内行走，同时嗅探或扫描物体的触须;我们没有计算坐在物体上的时间。在啮齿动物中，新奇是天生的;因此，记住熟悉事物的啮齿动物会花更多的时间探索新的事物。通过对每组的探索次数和辨别值进行记忆评价
恐惧条件反射测验
恐惧条件反射是根据我们之前的描述进行的简而言之，恐惧条件反射是在带有金属网格地板的声音衰减室中进行的(Coulborn指令)。这些网格被连接到一个电击发生器上，作为无条件刺激(US)，产生足部电击。音调和震动在各组之间是平衡的。在训练条件方面，将小鼠置于室内，允许其自由探索180 s(基线，BL)。然后，对小鼠进行4组恐惧条件反射，分别为30秒条件刺激(75 dB, 2800 Hz)和2秒条件刺激(0.5 mA)。内部间隔是80秒。在最后一次足震之后，小鼠在CS后的120秒内不受干扰。在情境测试中，在条件反射后约24小时，小鼠回到相同的条件反射室，并在180秒内对冻结行为进行评分，以测量情境条件反射恐惧。在提示测试中，老鼠被放置在另一个具有新环境的测试室中，在这个测试室中，金属网格地板被覆盖，墙壁被白色塑料取代。该试验在环境试验后24小时进行。老鼠被允许在这个三角形的房间里探索360秒。在最初的180年代(CS)，既没有CS也没有US;然后给予条件反射时呈现的听觉提示(CS+) 180 s。红外摄像机监测老鼠的冻结行为;使用FREEZEFRAME软件(版本4.07,Actimetrics, Coulborn directive)自动分析这些数据。
平衡木试验
平衡木(BB)步行测试用于评估运动性能和协调性横梁行走装置包括一个无盖的起跑台(白色，15 3 10 cm2)，一个黑色的球门(20 3 20 20 cm3)和一个1米长的横梁(1.5厘米宽的平面，位于地面上方50厘米处)。测试在连续3天内进行:两天的培训和一天的测试。以小鼠穿越横梁的次数和后爪滑倒次数作为横梁行走性能指标。在两次试验之间，用浸有75%乙醇的棉球清洗仪器。
细胞
定量逆转录酶PCR
原代星形胶质细胞的培养与处理
根据我们实验室先前使用的方案，从出生后(第1-3天)小鼠的大脑皮层获得初级星形胶质细胞简而言之，从小鼠身上分离的组织在冰冷的PBS中洗涤，并用无菌手术剪刀轻轻分离。将组织与0.25%胰蛋白酶(GIBCO)在37℃下孵育10 min，然后加入培养基停止胰蛋白酶消化，细胞悬液在200 g下离心5 min。细胞在培养基(DMEM/ F12 + 10% FBS + 100 U/mL青霉素/链霉素)中重悬，在6孔板中以23106个细胞2 mL-1的密度培养8-10天。第10天，星形胶质细胞在无血清条件培养基中分别用载药或1415 - eet (1mM)处理30min或3h。 收获细胞和培养基。对于vti1a -小干扰RNA (Vti1a-siRNA)的转染实验，在第8天，使用Lipofectamine RNAiMAX转染试剂(Thermo Fisher Scientific, 13778100)将Vti1a-siRNA转染原代星形胶质细胞48 h。然后将转染的星形胶质细胞在无血清条件培养基中用14、15EET处理30分钟。然后收集细胞和培养基进行分析。靶向Vti1a(基因ID: 53611)的siRNA序列为50 - ccagagaacugcuugaacat -30(正义)和50 -UGUUCAAGCAGUUCUCUGGTT-30(反义)。控制序列(感，50 - uucuccgaacguguucacgutt -30;反义，50 - acgugacacguucggagaat -30)作为打乱siRNA阴性对照。siRNA由Obio Technology (Shanghai, China)提供。
原代小胶质细胞培养和治疗
如前所述，小胶质细胞被分离出来在星形胶质细胞培养的第14天，通过摇动组织培养板1小时，收获松散粘附的小胶质细胞。在无血清的DMEM中，使用0.25%胰蛋白酶，以1:3的稀释率收获附着牢固的小胶质细胞30分钟。最后将松散和牢固粘附的小胶质细胞组合，在培养基中培养2天。然后，用14,15- eet (1 mM)或脂多糖(LPS, 100 ng/mL)处理小胶质细胞;Sigma-Aldrich)在无血清培养基中培养3小时，收获细胞进行mRNA分析或western blotting。
ELISA法测定ApoE浓度
采用商用ApoE ELISA试剂盒(Abcam, ab215086)在原代星形胶质细胞和小胶质细胞的无血清条件培养基和小鼠血浆中检测ApoE水平。这个程序是按照制造商的说明进行的。
细胞因子Bioplex试验
采用Bioplex Pro小鼠细胞因子23-plex试剂盒(Bio-Rad, M60009RDPD)检测33TgAD::Alb-CreERT2;Ephx2 - / -小鼠、33TgAD::rAAV-eYFP-Ephx2小鼠及其对照窝鼠血浆细胞因子水平。细胞因子面板包含IL-1a、IL-1b、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-12(p40)、IL-12(p70)、IL-13、IL-17a、Eotaxin、G-CSF、GM-CSF、IFN-g、KC、MCP-1、MIP-1a、MIP-1b、RANTES和TNF-a。简而言之，血浆样品在含有微珠的96孔板中孵育1小时，然后在室温下用细胞因子检测抗体孵育30分钟。然后使用Luminex 200系统(Luminex)在加入链霉亲和素- pe 10分钟后读取每孔的值。当值超出或在参考范围内时，将其分配为最高或最低标准的值。
分子对接
分子对接使用Scrodinger Suite 2015-4 (Maestro, Schro¨dinger, LLC)进行。69 .利用Ab42及其激动剂麦角胺(PDB ID: 1Z0Q)的晶体结构便于分析使用蛋白质制备向导对蛋白质结构进行处理。使用“LigPrep”将配体从2D结构转换为3D结构。在标准精度下，用Glide 6.9进行分子对接如果配体和蛋白残基之间的两个疏水原子的距离小于3.9 a˚，则计算为疏水相互作用;如果(1)该相互作用位于列出的供体和受体之间，(2)氢键周围原子形成的角度和距离符合默认标准，则计算为氢键。
渗透微型泵植入
渗透性微型泵植入如前所述简单地说，53FAD或33TgAD小鼠麻醉后，在右侧脑室(正后侧，AP = 0.6 mm;中外侧，ML = 1.2 mm;背腹侧，DV = 2.0 mm)。渗透泵的流速为0.5 mL/h，持续7天，泵内填充人工脑脊液(ACSF)或溶解在ACSF中的14,15- eet (200 ng/mL)。决定使用浓度为200 ng/mL的14,15- eet进行以下实验:6月龄53FAD或15月龄33TgAD小鼠体内不溶性Ab的浓度约为120 pmol/g(相当于50 ng/mL);与14,15- eet以4:1的比例孵育;这导致聚集的Ab解聚。因此，选择14,15- eet的最终浓度以避免体内代谢损失。
量化和统计分析
无标签蛋白质组学分析
按照上述方法处理53FAD::Alb-CreERT2;Ephx2/小鼠和对照窝鼠(53FAD::Ephx2loxp/loxp)的海马组织简而言之，我们将大约50 mg海马组织匀浆于500 mL含有HALT蛋白酶和磷酸酶抑制剂(Thermo Fisher Scientific)的裂解缓冲液(8 M尿素，100 mM NaHPO4, pH 8.5)中。将裂解物转移到新的微离心管中，超声，然后在15,000g下离心5分钟。然后将上清转移到一个新的管中。蛋白浓度采用BCA法测定(Thermo Fisher Scientific)。随后，使用过滤辅助样品制备程序消化提取的蛋白质。用1毫米二硫苏糖醇还原30分钟，然后在黑暗中用5毫米碘乙酰胺烷基化30分钟。将样品用50 mM三乙基碳酸氢铵稀释8倍后，按1:100 (w/w)加入赖氨酸内肽酶(Wako)过夜。用胰蛋白酶按1:50 (w/w)消化12 h。我们还将肽溶液酸化至1%甲酸(FA)和0.1%三氟乙酸(TFA)，并使用C18 Sep-Pak色谱柱(Waters)进行脱盐。用1ml甲醇、80%乙腈(ACN)和2ml 0.1% TFA分别活化、洗涤和平衡每个Sep-Pak柱。上样后，每个柱用1% TFA洗涤两次，用50% ACN洗脱两次。消化后，将肽溶液真空干燥。接下来，用0.2 pmol同位素标记的肽校准剂(Thermo Fisher Scientific, 88321)将衍生的肽重悬于肽负载缓冲液(0.1% FA, 0.03% TFA, 1% ACN)中。重悬肽用NanoAcquity UPLC (Waters)在C18柱(内径25 cm 3 75 mm)上分离，并用电子转移解离的Orbitrap融合三重质谱仪(Thermo Fisher Scientific)监测。在3-80%缓冲液B (0.1% FA, 0.5% l ArticleDMSO in ACN)的梯度(400 nL/min)下，分离至缓冲液a (0.1% FA, 5% DMSO in water)。质谱仪周期被编程为收集一个完整的MS扫描，然后是MS/MS扫描。MS扫描在m/z 200以70000的分辨率在剖面模式下收集，MS/MS扫描在200 m/z以17500的分辨率收集。动态排除设置为在10ppm窗口内排除先前测序的前体离子30 s。我们也排除了带有+1或R +6电荷态的前体离子。 无标记蛋白定量(LFQ)如前所述进行使用MaxQuant v1.5.3.30和Thermo Foundation 2.0对原始样本数据进行分析，以获得Raw文件读取能力。利用MaxQuant集成的Andromeda搜索引擎搜索连接的目标诱饵Uniprot小鼠参考蛋白数据库(检索于2015年8月;54,489个目标序列)。使用MaxQuant内置的LFQ算法进行蛋白质定量，该算法对样品之间的技术变化进行归一化。LFQ允许的最小比率计数为1。定量方法只考虑剃刀加独特肽的蛋白质水平定量。MaxQuant使用的完整参数列表可根据请求作为参数XML文件提供。 计算53FAD::Alb-CreERT2;Ephx2/小鼠和53FAD::Ephx2loxp/loxp窝鼠三个生物重复序列的平均提取离子电流(XIC)。为了确定哪些蛋白发生了改变，我们计算了53FAD::Alb-CreERT2;Ephx2/小鼠及其相对于对照窝鼠的XIC值的log2比率。基因本体(GO)术语和京都基因与基因组百科全书(KEGG)途径富集使用Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery (DAVID) 74通过Lable-free分析和途径富集结果鉴定的差异表达蛋白分别见表S2和表S3。
子主题
所有统计分析均使用统计软件GraphPad Prism, v.9.3.1进行，数据以均数±SEM表示。 以下统计检验用于行为、生化或组织学数据分析。两组间的比较采用非配对学生t检验(双尾)或多重t检验，然后采用Bonferroni校正。在三个或更多组的比较中，采用单向方差分析，然后采用Tukey 's或Dunnett 's事后检验。采用双方法重复测量方差分析和Bonferroni多重比较事后检验来评估组间可能的差异。采用双因素方差分析和Bonferroni事后检验对线索恐惧条件反射试验进行分析。生存差异采用双侧log-rank检验。使用Pearson相关分析确定相关性。采用二元logistic回归分析受试者工作特征(ROC)曲线。在进行方差分析和t检验时，假设数据分布为正态分布。p或调整后的p值< 0.05为显著性。采用TBtools软件进行聚类分析和热图分析统计参数包括样本量(n)、t/F值、p或调整后的p值，以及各实验采用的分析方法见表S6。