导图社区 毛细管等电聚焦电泳
毛细管等电聚焦电泳设备及方法学习,成像毛细管等电聚焦电泳imaging capillary electrofocusing electrophoresis,iCIEF
毛细管凝胶电泳(CGE)的思维导图,毛细管电泳 Capillary Electrophoresis (CE),以毛细管为分离泳道,以高压直流电场为驱动力,根据样品中各组分之间迁移速度(电泳淌度)和分配行为上的差异而实现分离的新型液相分离技术
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思维导图
基本知识
概念
成像毛细管等电聚焦电泳
imaging capillary electrofocusing electrophoresis,iCIEF
目的
分析单抗的电荷异质性
治疗性单抗类制品在生产、纯化、储存、运输过程中可能发生脱酰胺化、N 端焦谷氨酸基团修饰、异构化、唾液酸化和C 端赖氨酸裁剪等蛋白质修饰作用,导致电荷变异体的形成;而某些电荷变异体因对单抗分子的稳定性及其生物学功能的发挥具有重要影响,故成为关键质量属性
电荷变异体也可作为生产工艺稳定性的监控指标
iCE3 IOQ
检测器线性检查
最大曝光时间对应的响应值;1/2最大曝光时间对应的相应值
计算两个响应值比值,符合接受标准,呈线性
工程师专用诊断软件
检测器噪音检查
测试2000个像素点的光吸收值,测试三次
用Excel计算2000个吸收值的平均偏差
三次运行平均标准偏差需满足可接受标准
高压检查
在软件中设置聚焦电压500V、1500V、3000V, 聚焦时间1分钟
记录电压值满足可接受标准
自动进样器样品瓶温度检查
样品盘温度设置4℃,实际测试温度满足:2-6℃
样品盘温度设置25℃,实际测试温度满足:23-27℃
压力检查
进样器压力设置为500mBar, 实际压力值满足:450-550mBar;
进样器压力设置为1000mBar, 实际压力值满足:950-1050mBar;
进样器压力设置为2000mBar, 实际压力值满足:1950-2050mBar;
软件确认
文件置信度测试
启动iCE软件IQ.exe程序。结果是一个所需文件的列表,这些文件已经过验证,具有正确的修订日期,并已正确安装。打印最终信任报告
工程师专用软件测试,测试采集软件是否能正常运行,检查文件是否缺失
数据处理测试
使用iCE CFR软件和Chromperfect对标准数据文件Hb1进行处理。方法文件Hb1.MET。打印自定义报告,报告中的报告值必须与下面显示的参考报告一致。
检查文件是否能够正常分析,并生成报告
氘灯运行时间
Maintenance > Configuration,查看氘灯运行时间(For Information Only)
iCE3 系统确认
卡盒安装
曝光时间测试
转移时间测试
系统适用性测试
三针血红蛋白溶液判断设备系统适用性
成像毛细管等电聚焦电泳学习总结—李婷婷 2023.09
检测方法
设备操作
Buffer 盘放置
Z1-Z5 位:0.5%甲基纤维素
Z6-Z10 位:纯化水或HPLC级水
Z11位:空进样瓶
Z15:转移时间溶液
安装
检查漏液并安装卡盒
加入阴阳极电解液
毛细管光强度校准
确保在光路上不存在可见缺陷
卡盒背景光强度的最大值满足在3600至3950AU之间
光强度的最低点须大于最大值的1/2
判定在样品进样的过程中,需要多长时间样品才可以充满整个毛细管
60秒前到达稳定水平
平台高度大于5 μA
溶液配制
血红蛋白对照溶液
设备系统适用性(供应商提供推荐)
主混合物溶液
水
8 M 尿素
助溶剂(抑制蛋白沉淀、管壁吸附,提高分离效率)
1%甲基纤维
用凝胶辅助抑制电渗流,减少扩散
两性电解质
形成pH梯度
pI标记物
校正定位
空白/参考标准品/样品
按照各方法要求进行稀释配制
可接受标准
空白
不应有与参考标准品或样品电泳图中观察到的峰相干扰的峰。
2个pI标记物和4个主要的蛋白峰(HbA、HbF、HbS和HbC)应被检测到。
分离度可接受标准:观察到HbA1c的肩峰。
精密度可接受标准:HbA的pI值在供应商的产品说明书中规定的pI精度范围内。
高pI标记物的峰高必须>0.05AU的吸光度值。
参考标准品
主峰pI值的相对标准偏差应≤0.5%。
主峰面积的相对标准偏差应≤10%。
总峰面积的相对标准偏差(酸性、主峰和碱性异构体)应≤10%。
样品
每张电泳图中必须同时有两个pI标记物。
重复进样两针的总峰面积差异百分比应≤10%。
报告
报告每个样品主峰pI的平均值
报告每个样品的总酸性峰、主峰和总碱性峰的峰面积百分比平均值
设备原理
蛋白质等电点描述
蛋白质是两性电解质,其等电点和它所含的酸性氨基酸和碱性氨基酸的数量比例有关
在某一 pH 的溶液中,蛋白质解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等,所带静电荷为零,呈电中性,此时溶液的pH 成为该蛋白质的等电点
当溶液 pH < 蛋白质 pI ,蛋白质质子化带正电,通电时向阴极移动
当溶液 pH > 蛋白质 pI ,蛋白质释放质子带负电,通电时向阳极移动
工作原理
当蛋白的pI与周围环境的pH不同时,蛋白会沿着电场进行运动
蛋白运动速度的快慢取决于其所带静电荷的多少
当蛋白到达其等电点时,聚焦结束
大致总结
全柱成像毛细管等电聚焦电泳可在一个pH梯度下根据蛋白所带电荷的不同来实现蛋白的分离。在外加电场的作用下,蛋白的电荷异质体在两性电解质形成的连续pH梯度中迁移,在pH与pI相等的位置上停止迁移。