毛细管凝胶电泳(CGE)-李婷婷 2023.09

毛细管凝胶电泳(CGE)的思维导图，毛细管电泳 Capillary Electrophoresis (CE)，以毛细管为分离泳道，以高压直流电场为驱动力，根据样品中各组分之间迁移速度（电泳淌度）和分配行为上的差异而实现分离的新型液相分离技术

毛细管凝胶电泳（CGE）-李婷婷 2023.09

• 分析程序
  • 运行前仪器操作
    • 在开始运行前，让氘灯至少预热30分钟
    • 每次运行前清洁毛细管末端和电极
    • 检查冷却液液位
    • 卡盒正确安装
    • 准备Buffer盘
  • 仪器方法建立
    • 预处理毛细管方法Pre-Conditioning Capillary Method
      • NaOH淋洗
      • HCL淋洗
      • 水淋洗
      • SDS凝胶淋洗
      • 分离
    • 分离方法Separation Method
      • NaOH淋洗
      • HCL淋洗
      • 水淋洗
      • SDS凝胶淋洗
      • 等待（用水浸没淋洗毛细管）
      • 等待（用水浸没淋洗毛细管）
      • 样品进样
      • 等待（用水浸没淋洗毛细管）
      • 分离
      • 自动归零
    • 关机方法Shutdown Method
      • NaOH淋洗
      • HCL淋洗
      • 水淋洗
      • SDS凝胶淋洗
      • 分离
      • 等待（用水浸没淋洗毛细管）
      • 关灯
  • 溶液配制
    • 主混合溶液
      • SDS缓冲液
      • 烷基化试剂或还原试剂
        • 碘乙酰胺
        • β-巯基乙醇
      • 超纯水
    • 空白
      • 主混合溶液＋超纯水
    • 参比品
      • 主混合溶液＋特定浓度（稀释后）的参比品
    • 样品
      • 主混合溶液＋特定浓度（稀释后）的样品
    • • 孵育
      • 冷却
      • 离心
      • 转移至内插管中
      • 小管放置在进样瓶中
  • 序列
    • Preconditioning
    • 空白
    • 标准品
    • 样品
    • 标准品（回测）
    • Shutdown
    • 可接受标准
      • 空白
        • 样品峰所在区域不得有干扰峰
      • 还原参考标准品
        • 所有参考标准品进样纯度%（LC+HC）的相对标准偏差必须≤2%
      • 非还原参考标准品
        • 所有参考标准品进样纯度%（主峰）的相对标准偏差必须≤2%
      • 样品
        • 还原样品
          • 主峰%（Main)
          • 低分子量%(LMW)
        • 非还原样品
          • 纯度%（LC+HC）
          • 轻链%（LC）
          • 重链%（HC）
          • 非糖基化重链%（NG-HC）
      • 计算
        • 时间校正峰面积TCA
          • 峰面积 / 迁移时间
        • 速度校正峰面积VCA
          • L（检测器到毛细管长度）×峰面积 / 迁移时间
        • 为什么使用校正峰面积
          • 因焦耳热，过长的迁移时间会导致峰展宽，使面积判断有误，校正峰面积主要是为了校正迁移时间的漂移带来的定量偏差
  • 分析图谱
    • 还原
    • 非还原
    • HR/HS
• 方法介绍
  • 两种方法
    • Reduced CGE-SDS 还原毛细管凝胶电泳
      • 分析蛋白分子在还原试剂的作用下，二硫键断开，特定的轻链、重链、非糖基化重链和其他碎片杂质的分离
      • SDS 样品缓冲液+ 还原性试剂（还原性试剂可以在加热过程中起到打开蛋白中二硫键的作用）
    • Non-Reduced CGE-SDS 非还原毛细管凝胶电泳
      • 分析完整的蛋白分子特定的碎片和其他杂质成分。
      • SDS 样品缓冲液+ 烷基化试剂（烷基化试剂可以在加热过程中起到保护二硫键的作用）
  • 两种分离
    • 高分辨率 High Resolution（HR）
    • 高速 High Speed （HS）
• 设备介绍
  • 型号
    • PA800 Plus
  • 组成
    • 驱动系统
      • 高压电源
        • 高压电源可提供的最大电压为 30 kV，最大电流为 300 μA
      • 气压泵
        • 提供 0.1 psi 到 25 psi （1725 mbar）的进样压力，保证凝胶的填充
        • 提供 100 psi（6.9 bar） 的冲洗压力，保证毛细管冲洗的彻底性
        • 提供 0.1 psi 到 5.0 psi 的真空注入，可同时向毛细管两端施加压力，以防止凝胶脱气
    • 分离系统
      • 毛细管
      • 毛细管卡盒
    • 承载系统
      • 缓冲液托盘
      • 样品托盘
    • 检测系统
      • 光电二极管阵列 (PDA) 检测器
      • 紫外（UV） 检测器
      • 激光诱导荧光（LIF） 检测器
    • 温控系统
      • 毛细管控温
        • 毛细管的温度由循环通过卡盒的惰性液体（冷却液）控制
        • 低于室温 10℃ （最低15 ℃ ）- 60 ℃之间。
      • 样品室控温
        • 半导体控制的样品温控系统
        • 4-60℃
    • 显示系统
      • 电脑
      • 软件
        • 32 Karat 控制软件
• 分离原理
  • 前处理
    • 在蛋白样品的预处理过程中加入SDS(十二烷基硫酸钠（SDS）是一种强烈的阴离子蛋白质变性剂)使之变性，使得分子内和分子间氢键断裂，蛋白的构象由立体变为链状结构,去除蛋白折叠
    • SDS包裹蛋白表面，使蛋白分子带上均一的负电荷，形成一个较为稳定的荷质比，即每克伸展的蛋白结合1.4g的SDS,消除自身电荷在电泳分离中的影响
  • 电泳分离
    • 在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子的大小。与此同时，将凝胶作为毛细管中的填充物，起到分子筛的作用，能够将溶质按分子大小逐一分离
• 基本介绍
  • 概念
    • 毛细管电泳 Capillary Electrophoresis (CE)
      • 以毛细管为分离泳道，以高压直流电场为驱动力，根据样品中各组分之间迁移速度（电泳淌度）和分配行为上的差异而实现分离的新型液相分离技术
    • 毛细管凝胶电泳 Capillary Gel Glectrophoresis, CGE
      • 将板上的凝胶移到毛细管中作支持物进行的电泳。凝胶具有多孔性,起类似分子筛的作用, 溶质按分子大小逐一分离。
  • 目的
    • 纯度分析
      • 测定蛋白质杂质（片段）
      • 测定蛋白质轻重链比例