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高效液相色谱(HPLC)知识汇总
高效液相色谱(HPLC)知识汇总的思维导图，流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用(吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和)的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。
编辑于2023-09-19 20:43:50 湖南- 相似推荐
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HPLC知识汇总
概况
分离原理
流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用(吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和)的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出
别名
色层法、层析法
渊源
俄国植物学家茨维特(Tswett)在1906 年研究用碳酸钙分离植物色素时发现，色谱法(Chromatography)因之得名
发展
纸色谱
气相色谱
液相色谱
薄层色谱
色谱分类
按物理状态
气相色谱(GC)
分离挥发性化合物
细分(固定相不同)
气固色谱法(GSC)
气液色谱(GLC)
应用广
液相色谱(LC)
分离低挥发性或非挥发性、热稳定性差的物质
细分
液固色谱(LSC)
液液色谱(LLC)
超临界流体色谱法(SFC)
流动相
超临界流体(界于气体和液体之间的一种物相)(常用CO2)
优点
扩散系数大，快速达到平衡
分析时间短
应用
手性化合物的拆分
按原理
吸附色谱法(AC)
分配色谱法(DC)
离子交换色谱法(IEC)
排阻色谱法(EC，又称分子筛)
凝胶过滤(GFC)
凝胶渗透色谱(GPC)
亲和色谱
电泳
按操作形式
纸色谱(PC)
薄层色谱(TLC)
柱色谱
经典液相色谱
大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相
柱效低、时间长(常有几个小时)
高效液相色谱
于60 年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展
填料颗粒小而均匀
小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相
别名
高压液相色谱
高压输送流动相
高速液相色谱
分析速度快
现代液相色谱
特点
高压
可达150~300Kg/cm2，色谱柱每米降压75 Kg/cm2 以上
高速
流速为0.1~10.0 ml/min
高效
可达5000 塔板每米，一根柱中同时分离成份可达100 种
高灵敏度
紫外检测器灵敏度可达0.01ng，同时消耗样品少
优点
速度快
通常一个样品在15~30 min，有些样品甚至在5 min 内
分辨率高
可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果
灵敏度高
紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg
柱子可反复使用
一根色谱柱可分离不同的化合物
样品量少，容易回收
样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备
HPLC分类
分离机制
液固吸附色谱
固体吸附剂
分离原理
固定相对组分吸附力大小不同
常用的吸附剂
硅胶
氧化铝
粒度
5~10μm
应用
组分分子量200~1000，大多数用于非离子型化合物(离子型化合物易产生拖尾)，常用于分离同分异构体
液液分配色谱
将特定的液态物质涂于基质(担体)表面，或化学键合于担体表面而形成的固定相
分离原理
组分在流动相和固定相中溶解度不同，分离过程是一个分配平衡过程
注意事项
涂布式固定相应具有良好的惰性
流动相必须预先用固定相饱和，以减少固定相从担体表面流失
温度的变化和不同批号流动相的区别常引起柱子的变化
流动相中存在的固定相使样品分离和收集复杂化
涂布式固定相缺点
很难避免固定液流失
已很少采用，多采用化学键合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱
细分
固定相和流动相极性不同
正相(NPC)
极性固定相
聚乙二醇、氨基与腈基键合相等
相对非极性流动相
疏水性溶剂(烷烃类如正已烷、环已烷)
常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等调节组分保留时间
应用
分离中等极性和极性较强的化合物(如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等)
极性小先洗出
反相(RPC)
非极性固定相(如C18、C8)
极性流动相(水或缓冲液)
常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂调节保留时间
应用
分离非极性和极性较弱的化合物
应用最广
HPLC 应用的80%
极性大先洗出
注意事项
控制流动相pH值
控制样品解离
方法：加缓冲液
C18、C8常用pH值
2-8
过高
硅胶溶解
过低
键合烷基脱落
离子交换色谱
原理
树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行可逆交换，根据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分离
固定相
离子交换树脂
常用苯乙烯与二乙烯交联形成聚合物骨架，表面未端芳环上接上羧基、磺酸基(称阳离子交换树脂)或季氨基(阴离子交换树脂)
流动相
常用缓冲液
受流动相的pH 值和离子强度
注意事项
保留时间的影响因素
组分离子与树脂上的离子交换基团作用强弱
流动相的pH 值
改变化合物的解离程度
影响其与固定相的作用
流动相的离子强度
盐浓度大，则离子强度高，不利于样品的解离，导致样品较快流出
应用
分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸
离子对色谱
别名
偶离子色谱法
原理
根据被测组分离子与离子对试剂离子形成中性的离子对化合物后，在非极性固定相中溶解度增大，从而使其分离效果改善
应用
分析离子强度大的酸碱物质
碱性物质
离子对试剂为烷基磺酸盐，如戊烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等(另外高氯酸、三氟乙酸也可与多种碱性样品形成很强的离子对)
酸性物质
常用四丁基季铵盐，如四丁基溴化铵、四丁基铵磷酸盐
分子排阻色谱
固定相
有一定孔径的多孔性填料
流动相
可以溶解样品的溶剂
原理
利用分子筛对分子量大小不同的各组分排阻能力的差异而完成分离
小分子量化合物进入孔中，滞留时间长；大分子量化合物不能进入孔中，直接随流动相流出
应用
常用于分离高分子化合物，如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等
概念和术语
色谱图和峰参数
色谱图(chromatogram)
样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线(elution profile)
基线(base line)
经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线，一般应平行于时间轴
噪音(noise)
基线信号的波动
通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致
漂移(drift)
基线随时间的缓缓变化
主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移
色谱峰(peak)
组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线上的突起部分
正常色谱峰
近似于对称形正态分布曲线(高斯Gauss 曲线)
不对称色谱峰
前延峰(leading peak)
拖尾峰(tailing peak)
拖尾因子(tailing factor，T)
用以衡量色谱峰的对称性
别名
对称因子(symmetry factor)或不对称因子(asymmetry factor)
《中国药典》规定T 应为0.95~1.05。T＜0.95为前延峰，T＞1.05 为拖尾峰
峰底
基线上峰的起点至终点的距离
峰高(peak height，h)
峰的最高点至峰底的距离
峰宽(peak width，W)
峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。W＝4σ
半峰宽(peak width at half-height，Wh/2)
峰高一半处的峰宽。Wh/2＝2.355σ
标准偏差(standard deviation，σ)
正态分布曲线x＝±1 时(拐点)的峰宽之半
正常峰的拐点在峰高的0.607 倍处
标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程度
σ 小，分散程度小、极点浓度高、峰形瘦、柱效高
σ 大，峰形胖、柱效低
峰面积(peak area，A)
峰与峰底所包围的面积
定性参数
死时间(dead time，t0)
不保留组分的保留时间，即流动相(溶剂)通过色谱柱的时间
在反相HPLC 中可用苯磺酸钠来测定死时间
死体积(dead volume，V0)
由进样器进样口到检测器流动池未被固定相所占据的空间
柱内固定相颗粒间隙(被流动相占据，Vm)
其中只有Vm 参与色谱平衡过程
柱出口管路体积
进样器至色谱柱管路体积
检测器流动池体积
只起峰扩展作用，为防止峰扩展，这3 部分体积应尽量减小
V0＝F×t0(F 为流速)
保留时间(retention time，tR)
从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间
保留体积(retention volume，VR)
从进样开始到某组分在柱后出现浓度极大值时流出溶剂的体积，又称洗脱体积。
VR＝F×tR
调整保留时间(adjusted retention time，t'R)
扣除死时间后的保留时间，也称折合保留时间(reduced retention time)
在实验条件(温度、固定相等)一定时，t'R 只决定于组分的性质，因此，t'R(或tR)可用于定性
t'R＝tR－t0
调整保留体积(adjusted retention volume，V'R)
扣除死体积后的保留体积
柱效参数
理论塔板数(theoretical plate number，N)
用于定量表示色谱柱的分离效率(简称柱效)
取决于固定相的种类、性质(粒度、粒径分布等)、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质
在一张多组分色谱图上，如果各组分含量相当，则后洗脱的峰比前面的峰要逐渐加宽，峰高则逐渐降低
用半峰宽计算理论塔数比用峰宽计算更为方便和常用，因为半峰宽更易准确测定，尤其是对稍有拖尾的峰
若用调整保留时间(t'R)计算理论塔板数，所得值称为有效理论塔板数(N 有效或Neff)
N 与柱长成正比，柱越长，N 越大
用N 表示柱效时应注明柱长，如果未注明，则表示柱长为1 米时的理论塔板数(一般HPLC 柱的N 在1000 以上)
理论塔板高度(theoretical plate height，H)
每单位柱长的方差，实际应用时往往用柱长L和理论塔板数计算
相平衡参数
分配系数(distribution coefficient，K)
在一定温度下，化合物在两相间达到分配平衡时，在固定相与流动相中的浓度之比
分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有关，也与温度、压力有关
概念因时而异
吸附色谱为吸附系数
离子交换色谱为选择性系数(或称交换系数)
凝胶色谱为渗透参数
理想状态
在条件(流动相、固定相、温度和压力等)一定，样品浓度很低时(Cs、Cm 很小)时，K只取决于组分的性质，而与浓度无关
色谱峰为正常峰
变化
一般情况
随着溶质浓度的增大，K 减小
拖尾峰
特殊情况
随着溶质浓度增大，K 也增大
前延峰
尽可能减少进样量，使组分在柱内浓度降低，K 恒定时，才能获得正常峰
K值VS组分流出时间
同色谱条件，样品中K 值大的组分在固定相中滞留时间长，后流出色谱柱
K值小的组分则滞留时间短，先流出色谱柱
混合物中各组分的分配系数相差越大，越容易分离
容量因子(capacity factor，k)
定义
化合物在两相间达到分配平衡时，在固定相与流动相中的量之比，因此容量因子也称质量分配系数
物理意义
表示一个组分在固定相中停留的时间(t'R)是不保留组分保留时间(t0)的几倍
k＝0 时，化合物全部存在于流动相中，在固定相中不保留，t'R＝0
k 越大，说明固定相对此组分的容量越大，出柱慢，保留时间越长
与分配系数的差异
分配系数K取决于组分、流动相、固定相的性质及温度，而与体积Vs、Vm 无关
容量因子k除了与性质及温度有关外，还与Vs、Vm 有关
由于t'R、t0 较Vs、Vm 易于测定，所以比分配系数应用更广泛
选择性因子(selectivity factor，α)
相邻两组分的分配系数或容量因子之比，α 又称为相对保留时间(《美国药典》)
要使两组分得到分离，必须使α≠1
与化合物在固定相和流动相中的分配性质、柱温有关，与柱尺寸、流速、填充情况无关
本质上，α 的大小表示两组分在两相间的平衡分配热力学性质的差异，即分子间相互作用力的差异
分离参数
分离度(resolution，R)
相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值，也叫分辨率，表示相邻两峰的分离程度
当R＝1 时，称为4σ 分离，两峰基本分离，裸露峰面积为95.4%，内侧峰基重叠约2%
R＝1.5 时，称为6σ 分离，裸露峰面积为99.7%，R≥1.5 称为完全分离
提高方法
增加塔板数
增加柱长，但这样会延长保留时间、增加柱压
降低塔板高度，提高柱效，是更好的方法
增加选择性
当α＝1 时，R＝0，无论柱效有多高，组分也不可能分离
一般方法
改变流动相的组成及pH 值
改变柱温
改变固定相
改变容量因子k
常是提高分离度的最容易方法，可以通过调节流动相的组成来实现
k 趋于0 时，R 也趋于0；k 增大，R 也增大
但k不能太大，否则不但分离时间延长，而且峰形变宽，会影响分离度和检测灵敏度
一般k在1~10 范围内，最好为2~5，窄径柱可更小些
HPLC系统
输液泵
最重要的部件之一
影响到整个系统的质量和分析结果的可靠性
性能要求
流量稳定，RSD 应＜0.5%
对定性定量的准确性至关重要
流量范围宽
分析型0.1~10 ml/min
制备型达100ml/min
输出压力高，一般应能达到150~300kg/cm2
液缸容积小
密封性能好，耐腐蚀
分类
按输液性质
恒压泵
受柱阻影响，流量不稳定
已被淘汰
恒流泵
按结构
螺旋注射泵
缸体太大，已被淘汰
柱塞往复泵
目前应用最多
液缸容积小，可至0.1ml
易于清洗和更换流动相，特别适合于再循环和梯度洗脱
改变电机转速能方便地调节流量，流量不受柱阻影响
泵压可达400kg/cm2
缺点
输出的脉冲性较大，现多采用双泵系统来克服
双泵按连接方式
并联式
并联泵的流量重现性较好(RSD 为0.1%左右)
出故障的机会较多(因多一单向阀)，价格也较贵
串联式
RSD为0.2~0.3%
隔膜往复泵
注意事项
防止任何固体微粒进入泵体
磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀
预先除去流动相中的任何固体微粒
流动相最好在玻璃容器内蒸馏
常用的方法是过滤，滤膜(0.2μm或0.45μm)
泵的入口都应连接砂滤棒或片
输液泵的滤器应经常清洗或更换
流动相不应含腐蚀性物质
含缓冲液流动相不应保留在泵内，尤其停泵过夜或更长时间
含缓冲液的流动相可能析出盐的微细晶体
晶体损坏密封环和柱塞等
须泵入纯水将泵充分清洗后，再换成适合于色谱柱保存和有利于泵维护的溶剂(反相键合硅胶固定相，可用甲醇或甲醇-水)
防止溶剂瓶内的流动相用完
空泵运转会磨损柱塞、缸体或密封环，最终产生漏液
工作压力决不得超最高压力
会使高压密封环变形，产生漏液
流动相应该先脱气
以免泵内产生气泡，影响流量的稳定性
如果有大量气泡，泵就无法正常工作
故障及排除
没有流动相流出，又无压力指示
泵内有大量气体
可打开泄压阀，使泵在较大流量(如5ml/min)下运转，将气泡排尽
用针筒在泵出口处帮助抽出气体
密封环磨损
更换
压力和流量不稳
气泡
排除气泡
单向阀内有异物
卸下单向阀，浸入丙酮内超声清洗
砂滤棒内有气泡，或被盐的微细晶粒或滋生的微生物部分堵塞
卸下砂滤棒浸入流动相内超声除气泡
将砂滤棒浸入稀酸(如4mol/L 硝酸)内迅速除去微生物
将盐溶解，再立即清洗
压力过高
管路被堵塞
清除和清洗
压力降低
管路有泄漏
洗脱方式
等强度(isocratic)
同一分析周期内流动相组成保持恒定
适合组分数目较少，性质差别不大的样品
梯度(gradient)
一个分析周期内程序控制流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度和pH 值等
用于分析组分数目多、性质差异较大的复杂样品
可缩短分析时间
提高分离度
改善峰形
提高检测灵敏度
常引起基线漂移和降低重现性
实现方式
低压梯度(外梯度)
高压梯度(内梯度)
多种洗脱曲线
线性梯度
最常用
尤其适合于反相柱
凹形梯度
凸形梯度
阶梯形梯度
注意事项
注意溶剂的互溶性
不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相
有些溶剂在一定比例内混溶，超出范围后就不互溶
有机溶剂和缓冲液(尤其磷酸盐)混合时，可能析出盐的晶体
溶剂纯度要求更高
保证良好的重现性
分析前必须进行空白梯度洗脱，以辨认溶剂杂质峰
弱溶剂中的杂质富集在色谱柱头后会被强溶剂洗脱下来
溶剂需彻底脱气，以防止混合时产生气泡
混合溶剂的粘度常随组成而变化
梯度洗脱时常出现压力的变化
甲醇和水粘度都较小，二者以相近比例混合时粘度增大，柱压是甲醇或水为流动相时的2倍
防止梯度洗脱过程超压
每次梯度洗脱之后必须对色谱柱进行再生处理，使其恢复到初始状态
10~30倍柱容积的初始流动相流经色谱柱，使固定相与初始流动相达到完全平衡
进样器
要求
密封性好
死体积小
重复性好
保证中心进样
进样时对色谱系统的压力、流量影响小
进样方式
隔膜进样
用微量注射器将样品注入专门设计的与色谱柱相连的进样头内
优点
可把样品直接送到柱头填充床的中心，死体积几乎等于零
可获得最佳的柱效
价格便宜
操作方便
缺点
不能在高压下使用(如10MPa 以上)
隔膜容易吸附样品产生记忆效应，使进样重复性只能达到1~2%
耐各种溶剂的橡皮不易找到，常规分析使用受到限制
停流进样
优点
可避免在高压下进样
在以峰的始末信号控制馏分收集的制备色谱中，效果较好
缺点
由于隔膜污染，停泵或重新启动时易出现“鬼峰”
保留时间不准
阀进样
常用六通进样阀
关键部件
圆形密封垫(转子)
固定底座(定子)
进样方式
部分装液
进样量应不大于定量环体积的50%(最多75％)
每次进样体积应准确、相同
准确度和重复性决定于注射器取样的熟练程度
易产生由进样引起的峰展宽
完全装液
进样量应不小于定量环体积的5~10 倍(最少3 倍)
完全置换定量环内的流动相，消除管壁效应，确保进样的准确度及重复性
注意事项
样品溶液进样前必须用0.45μm滤膜过滤，减少微粒对进样阀的磨损
转动阀芯时不能太慢，更不能停留在中间位置
否则流动相受阻，使泵内压力剧增，甚至超过泵的最大压力
再转到进样位时，过高的压力将使柱头损坏
防止缓冲盐和样品残留在进样阀中
每次分析结束后应冲洗进样阀
通常用水冲洗，或先用能溶解样品的溶剂冲洗，再用水冲洗
优点
耐高压(35~40MPa)
进样量准确
重复性好(0.5%)
操作方便
缺点
阀接头和连接管存在死体积
柱效率低于隔膜进样(约下降5~10%左右)
自动进样
大量样品的常规分析
色谱柱
要求
柱效高
选择性好
分析速度快
柱的构造
柱管
多为不锈钢
压力不高于70 kg/cm2 时，也可采用厚壁玻璃或石英管
管内壁要求有很高的光洁度
压帽
卡套(密封环)
筛板(滤片)
烧结不锈钢或钛合金
防止填料漏出
接头
螺丝
填料
无机基质
硅胶
最普遍的基质，尤其是小分子
特点
高强度
提供一个表面
键合上各种配基
制成反相、离子交换、疏水作用、亲水作用或分子排阻色谱用填料
缺点
在碱性水溶性流动相中不稳定
常规分析pH 范围2~8
应用
极性和非极性溶剂
性能参数
平均粒度及其分布
平均孔径及其分布
与比表面积成反比
比表面积
在液固吸附色谱中，硅胶的比表面积越大，溶质的k值越大
含碳量及表面覆盖度(率)
在反相色谱法中，含碳量越大，溶质的k 值越大
含水量及表面活性
在液固吸附色谱中，硅胶含水量越小，其表面硅醇基的活性越强
对溶质的吸附作用越大
端基封尾
在反相色谱中，主要影响碱性化合物的峰形
几何形状
无定形全多孔硅胶
价格较便宜
涡流扩散项及柱渗透性差
球形全多孔硅胶
硅胶纯度
对称柱填料使用高纯度硅胶，柱效高，寿命长，碱性成份不拖尾
氧化铝
硅胶相同的良好物理性质
能耐较大的pH范围
氧化铝键合相在水性流动相中不稳定(与硅胶不同)
现在已经出现了在水相中稳定的氧化铝键合相
多孔碳
刚性大，在溶剂中不容易膨胀
有机基质
有机聚合物微球(包括离子交换树脂)
交联苯乙烯-二乙烯苯
疏水性强
可以用NaOH 或强碱来清洗色谱柱
聚甲基丙烯酸酯
比苯乙烯-二乙烯苯疏水性更强
可通过适当的功能基修饰变成亲水性的
不如苯乙烯-二乙烯苯那样耐酸碱
可以承受在pH13 下反复冲洗
刚性小、易压缩，溶剂或溶质容易渗入其中，导致填料颗粒膨胀
结果减少传质，最终使柱效降低
压力限度比无机填料低
小分子在这种基质中柱效低
应用
广泛用于分离大分子物质
用来制成分子排阻和离子交换柱
基质选择
粒度
3、5、7、10μm
柱效
理论值
达5~16 万塔板数/米
一般分析
5000
同系物分析
500
于较难分离物质
2万
影响因素
柱外死体积
柱结构
管壁效应
柱中心部位和沿管壁部位的填充情况总是不一样，靠近管壁的部位比较疏松，易产生沟流，流速较快，影响冲洗剂的流形，使谱带加宽
分类
按用途
分析型
常规分析柱(常量柱)，内径2~5mm(常用4.6mm，国内有4mm 和5mm)，柱长10~30cm
窄径柱(narrow bore，又称细管径柱、半微柱semi-microcolumn)，内径1~2mm，柱长10~20cm
毛细管柱(又称微柱microcolumn)，内径0.2~0.5mm
制备型
半制备柱，内径＞5mm
实验室制备柱，内径20~40mm，柱长10~30cm
生产制备柱
内径可达几十厘米，柱内径一般是根据柱长、填料粒径和折合流速来确定，目的是为了避免管壁效应
发展趋势
短
分析速度快
窄
提高分析灵敏度
与质谱(MS)联接
细管径柱的优点
节省流动相
灵敏度增加
样品量少
能使用长柱达到高分离度
容易控制柱温
易于实现LC-MS 联用
小体积柱的缺点
柱外效应影响增加
需要更小池体积的检测器(甚至采用柱上检测)
更小死体积的柱接头和连接部件
对配套设备要求
输液泵能精密输出1-100μl/min的低流量
进样阀能准确、重复地进样微小体积的样品
因上样量小，要求高灵敏度的检测器
注意事项
避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动
温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况
柱压的突然升高或降低会冲动柱内填料
调节流速时应该缓慢进行
在阀进样时阀的转动不能过缓
应逐渐改变溶剂的组成
特别是反相色谱中，不应直接切换全有机溶剂或水
一般说来色谱柱不能反冲
只有生产商指明可反冲时，才可反冲除去留在柱头的杂质，否则会迅速降低柱效
选择使用适宜的流动相(尤其是pH)
避免固定相被破坏
可在进样器前面连接一预柱
分析柱是键合硅胶时，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶"饱和"，避免分析柱中的硅胶基质被溶解
避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱内
对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一保护柱
保护柱一般是填有相似固定相的短柱
保护柱应经常更换
经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质
清洗时，流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡
清洗溶剂
强极性杂质
甲醇
硅胶表面重新活化
己烷
非极性杂质
一氯甲烷
类脂
四氢呋喃与乙腈或甲醇的混合溶液
蛋白质
乙腈、丙酮和三氟醋酸(0.1%)梯度洗脱
反相柱
以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷(或氯仿)依次冲洗，再以相反顺序依次冲洗
流动相不含缓冲液省略水冲洗
阳离子交换柱
稀酸缓冲液
阴离子交换柱
稀碱缓冲液
除去交换性能强的盐
然后用水、甲醇、二氯甲烷(除去吸附在固定相表面的有机物)、甲醇、水依次冲洗
保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇
柱接头要拧紧，防止溶剂挥发干燥
绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间
故障
压力升高
烧结滤片被堵塞
应更换滤片或将其取出进行清洗
大分子进入柱内，使柱头被污染
柱效降低或色谱峰变形
柱头出现塌陷，死体积增大
柱温箱
在线脱气机
检测器
要求
灵敏度高
噪音低(即对温度、流量等外界变化不敏感)
线性范围宽
重复性好
适用范围广
分类
按原理
光学检测器(如紫外、荧光、示差折光、蒸发光散射)
热学检测器(如吸附热)
电化学检测器(如极谱、库仑、安培)
电学检测器(电导、介电常数、压电石英频率)
放射性检测器(闪烁计数、电子捕获、氦离子化)
氢火焰离子化检测器
按测量性质
通用型
测量的是一般物质均具有的性质，它对溶剂和溶质组分均有反应
如示差折光、蒸发光散射检测器
灵敏度一般比专属型的低
专属型(又称选择性)
只能检测某些组分的某一性质，如紫外、荧光检测器，它们只对有紫外吸收或荧光发射的组分有响应
按检测方式
浓度型
响应与流动相中组分的浓度有关
质量型
响应与单位时间内通过检测器的组分的量有关
按对样品的破坏性
破坏样品
不破坏样品
性能指标
噪音和漂移
仪器稳定之后，记录基线1 小时，基线带宽为噪音，基线在1 小时内的变化为漂移
反映检测器电子元件的稳定性，及其受温度和电源变化的影响
若有流动相从色谱柱流入检测器，还反映流速(泵的脉动)和溶剂(纯度、含有气泡、固定相流失)的影响
噪音和漂移都会影响测定的准确度，应尽量减小
灵敏度
表示一定量的样品物质通过检测器时所给出的信号大小
浓度型检测器
表示单位浓度的样品所产生的电信号的大小，单位为mV·ml/g
质量型检测器
表示在单位时间内通过检测器的单位质量的样品所产生的电信号的大小，单位为mV·s/g
检测限(detection limit)
影响因素
噪声的大小，直接有关
检测器的噪声和灵敏度
色谱条件、色谱柱和泵的稳定性
各种柱外因素引起的峰展宽
又称敏感度(detectability)
恰好产生可辨别的信号(通常用2倍或3倍噪音表示)时进入检测器的某组分的量
浓度型检测器
指在流动相中的浓度，单位g/ml或mg/ml
与分析方法的检出限不同
质量型检测器
指的是单位时间内进入检测器的量，单位g/s 或mg/s)
计算
注入检测器已知量的标准溶液来测定其检测限
线性范围(linear range)
指检测器的响应信号与组分量成直线关系的范围，即在固定灵敏度下，最大与最小进样量(浓度型检测器为组分在流动相中的浓度)之比
也可用响应信号的最大与最小的范围表示，例如Waters 996 PDA 检测器的线性范围是-0.1~2.0A
池体积
除制备色谱外，大多数HPLC 检测器的池体积都小于10μl
细管径柱时，池体积应减少到1~2μl 甚至更低
否则检测系统带来的峰扩张问题就会很严重
细分
紫外可见外检测器(UV)
原理
基于被分析组分对特定波长紫外光的选择性吸收
定量基础
朗伯-比耳(Lambert-Beer)定律：A(吸光度)=εCL=-log(Eout/Ein)
优点
灵敏度高
对温度和流速不敏感
噪音低
线性范围宽
可用于梯度洗脱和制备色谱
缺 点
仅用于测定有紫外吸收的物质
应用
双波长检测
波长扫描
波长切换
注意事项
启动仪器或开灯后需要一定时间使基线稳定
检测流通池与管路是否漏液
检测时关闭前面板
清洗流通池防堵塞
标准流通池12μL，耐压12MPa，半微量流通池 2.5μL
氘灯：2000h，不可频繁开关(3h)
溶剂紫外吸收截止波长
将溶剂装入1cm 的比色皿，以空气为参比，逐渐降低入射波长，溶剂的吸光度A＝1 时的波长称为溶剂的截止波长，也称极限波长
溶剂杂质
溶剂中含吸光杂质，会提高背景噪音，降低灵敏度(实际是提高检测限)
梯度洗脱时，产生漂移
二极管阵列检测器(PDA)
原理
每个二极管测量一窄波段的光谱
可得到吸光度、波长、时间的三维色谱图
特点
扫描速度快，10ms一次检测
可发现单波长检测时未测到的峰
光谱定性、谱库搜索
峰纯度检验
注意事项
启动仪器或开灯后需要一定时间使基线稳定
检测流通池与管路是否漏液
检测时关闭前面板
清洗流通池防堵塞
标准流通池10μL，耐压12MPa，半微量流通池 2.5μL
氘灯：2000h，不可频繁开关(3h)
荧光检测器(PE)
优点
灵敏度和选择性极高，是最灵敏的检测器之一
对温度和流速不敏感，可用于梯度洗脱
缺点
仅适用于测定可产生荧光的物质或能通过衍生化反应产生荧光的物质
原理
基于被分析组分发射的荧光强度进行检测
应用
可检测多环芳烃、霉菌毒素、卟啉、儿茶酚氨(具有对称共轭体系)或氨基酸、脂肪酸等需衍生后检测样品
注意事项
启动仪器或开灯后需要一定时间使基线稳定
检测流通池与管路是否漏液
检测时关闭前面板
清洗流通池防堵塞
温度上升荧光强度下降
常温附近湿度变化超过1℃有些化合物强度变化达5%
标准流通池12μL，耐压2MPa
防止压力过高，样品池碎裂
氘灯：2000h，不可频繁开关
示差折光检测器(RID)
原理
基于连续测定柱后流出液折射率变化来测定样品的浓度
溶液折射率=纯溶剂流动相&纯溶质组分的折射率乘以各物质浓度之和
溶有组分的流动相和纯流动相之间折射率之差表示组分在流动相中的浓度
无样品通过时参比池与样品池液体折射率相同
反射回来的光在光电二极管中心在光敏无件上产生的电信号大小相等，方向相反，无信号输出
样品进测测量池时
液体折射率变化
引起折射光强度变化
照射到两个光敏无件上的光斑位置偏移
光敏无件接受的光强度不同
光强度之差正比于两池折射率之差
正比于样品浓度
优点
通用型可检测无紫外吸收的物质，如糖、烷烃
缺点
对温度变化敏感
对溶剂组成变化敏感，不可用于梯度检测
属于中等灵敏度的检测器
极测限为10^-7至10^-6g/ml
液体折射率随温度和压力变化
对温度和压力特别敏感
需恒温恒速操作
不可梯度洗脱
注意事项
开始分析前须调整参比池和样品池充满相同流动相
切换参比池几次，彻底排除气泡
最后关闭参比流路
检测时关闭前面板
清洗流通池防堵塞
流通池：9μL，耐压2MPa，进口63.5μL，出口280.2μL
钨灯：2000h
电导检测器(CDD)
原理
根据物质在某些介质中电离后所产生的电导率的变化来测定电离物质的含量
用两个相对电极测量柱后流出液中离子型溶质的电导，由电导的变化来测定溶质的含量
优点
离子色谱中使用最广
对流动相流速和压力改变不敏感
死体积小
灵敏度高
线性范围宽
缺点
对温度变化敏感
温度升高1℃电导率增加2%-5%
应用
离子色谱，检测无机和有机离子
环境科学、生物医药
注意事项
清洗流通池防堵塞
流通池：0.25μL，耐压2.9MPa
蒸发光散射检测器(ELSD)
原理
基于溶质的光散射性质制成
流出物在检测器中被高速氮气喷成雾状液滴，溶剂挥发后溶质形成微小颗粒，被载气带到检测系统，进入散射室中，检验散射光的强度。
优点
通用性强
通用型和质量型检测器
消除了溶剂干扰以及温度变化带来的基线漂移
对流动相组成温度变化不敏感
可梯度洗脱
灵敏度高
高于示差折光检测器
缺点
不能使用非挥发性缓冲盐做流动相，如磷酸盐
样品组分应是非挥发性或半挥发性
注意事项
废气不能排放在室内
如流动相中含有有机溶剂，使用惰性气体做雾化气
避免使用工作温度下可引起爆炸的溶剂和雾化气
流动相中不使用非挥发性盐
雾化气压力不要超过450kPa
先开气后开泵
先关泵再关气
保证雾化器虹吸出口充满液体
检测时关闭前面板
LED灯5000h
质谱检测器(LCMS)
优点
强大的定性和选择性
多组分样品准确定性
未充分分离组份峰鉴别
消除杂质干扰
可作为便捷的定性分析
用于合成和衍生反应的研究
作NMR分析的质谱鉴定
故障及排除
流动池内有气泡
气泡流经或停留在流动池内
噪音增大
突然增大流量的办法除去气泡(最好不连接色谱柱)
启动输液泵的同时，用手指紧压流动池出口，使池内增压，然后放开
可反复操作数次，不可压力增加太多，以免流动池破裂
气泡较大
基线上出现许多线状"峰"，这是由于系统内有气泡
需对流动相进行充分的除气，检查整个系统是否漏气，再加大流量驱除系统内的气泡
流动池被污染
参比池或样品池被污染，都可能产生噪音或基线漂移
用适当溶剂清洗检测池(注意溶剂的互溶性)
若污染严重
依次采用1mol/L 硝酸、水和新鲜溶剂冲洗
或取出池体进行清洗、更换窗口
光源灯出现故障
紫外或荧光检测器的光源灯使用到极限或者不能正常工作
产生严重噪音，基线漂移，出现平头峰等异常峰，甚至基线不回零
需更换光源灯
倒峰
可能检测器的极性接反了
改正后即可变成正峰
示差折光检测器
可能组分的折光指数低于流动相的折光指数
需要选择合适的流动相
紫外检测器
流动相中含有紫外吸收的杂质，无吸收的组分会产生倒峰
必须用高纯度的溶剂作流动相
在死时间附近的尖锐峰
可能由于进样时的压力变化
或由于样品溶剂与流动相不同所引起的
流动相
要求
低粘度
与检测器兼容性好
易于得到纯品
低毒性
与容量因子k值的关系
强溶剂使溶质在填料表面吸附减少，相应的容量因子k降低
弱溶剂使溶质在填料表面吸附增加，相应的容量因子k 升高
与塔板数的关系
塔板数N 一般与流动相的粘度成反比
流动相选择
流动相应不改变填料的任何性质
低交联度的离子交换树脂和排阻色谱填料有时遇到某些有机相会溶胀或收缩，从而改变色谱柱填床的性质
碱性流动相不能用于硅胶柱系统
酸性流动相不能用于氧化铝、氧化镁等吸附剂的柱系统
纯度
色谱柱的寿命与大量流动相通过有关，特别是当溶剂所含杂质在柱上积累时
必须与检测器匹配
使用UV 检测器时，所用流动相在检测波长下应没有吸收，或吸收很小
当使用示差折光检测器时，应选择折光系数与样品差别较大的溶剂作流动相，以提高灵敏度
粘度要低(应<2cp)
高粘度溶剂会影响溶质的扩散、传质，降低柱效，使柱压降增加，分离时间延长
最好选择沸点在100℃以下的流动相
对样品的溶解度要适宜
若溶解度欠佳
样品会在柱头沉淀
影响了纯化分离
柱子恶化
样品易于回收
应选用挥发性溶剂
流动相的特性
化学键合相色谱
溶剂的洗脱能力直接与它的极性相关
正相色谱
溶剂的强度随极性的增强而增加
流动相通常采用烷烃加适量极性调整剂
反相色谱
溶剂的强度随极性的增强而减弱
通常以水作基础溶剂，再加入一定量的能与水互溶的极性调整剂，如甲醇、乙腈、四氢呋喃等
极性调整剂的性质及、比例对溶质的保留值和分离选择性有显著影响
pH值
反相离子抑制技术
反相色谱法分离弱酸(3≤pKa≤7)或弱碱(7≤pKa≤8)样品时，通过调节流动相的pH 值，以抑制样品组分的解离，增加组分在固定相上的保留，并改善峰形的技术
对于弱酸
流动相的pH 值越小，组分的k 值越大，当pH 值远远小于弱酸的pKa 值时，弱酸主要以分子形式存在
对于弱碱
与弱酸相反
分析弱酸样品时
通常在流动相中加入少量弱酸，常用50mmol/L 磷酸盐缓冲液和1%醋酸溶液
分析弱碱样品时
通常在流动相中加入少量弱碱，常用50mmol/L 磷酸盐缓冲液和30mmol/L 三乙胺溶液
流动相中加入有机胺的作用
减弱碱性溶质与残余硅醇基的强相互作用
减轻或消除峰拖尾现象
有机胺(如三乙胺)又称为减尾剂或除尾剂
脱气
影响柱的分离效率
影响检测器的灵敏度、基线稳定性，甚至使无法检测(噪声增大，基线不稳，突然跳动)
溶解氧
可与样品、流动相甚至固定相(如烷基胺)反应
与某些溶剂(如甲醇、四氢呋喃)形成有紫外吸收的络合物
提高背景吸收(特别是在260nm 以下)，并导致检测灵敏度的轻微降低
在梯度淋洗时造成基线漂移或形成鬼峰(假峰)
在荧光检测中，溶解氧在一定条件下还会引起淬灭现象，特别是对芳香烃、脂肪醛、酮等。在某些情况下，荧光响应可降低达95%
在电化学检测中(特别是还原电化学法)，氧的影响更大
溶解气体可引起溶剂pH 的变化，对分离或分析结果带来误差
脱气方法
加热煮沸
对混合溶剂，需考虑低沸点溶剂挥发造成的组成变化
抽真空
对混合溶剂，需考虑低沸点溶剂挥发造成的组成变化
超声
许多有机溶剂或有机溶剂/水混合液10~20分钟(一般500ml 溶液20~30min)
不影响溶剂组成
应注意避免溶剂瓶与超声槽底部或壁接触，以免玻璃瓶破裂
容器内液面不要高出水面太多
吹氦
离线脱气
不能维持溶剂的脱气状态，停止脱气后，气体立即开始回到溶剂中，在1~4 小时内，溶剂又将被环境气体所饱和
在线脱气
最常用鼓泡法
将惰性气体喷入溶剂中
只是用一种低溶解度的惰性气体(通常是氦)将空气替换出
滤过
0.22或0.45μm
有机相(脂溶性)滤膜
过滤水溶液时流速低或滤不动
水相(水溶性)滤膜
严禁用于有机溶剂，否则滤膜会被溶解
混合流动相
混合前分别滤过
混合后滤过
有机相滤膜
混合型滤膜
贮存
一般用玻璃、聚四氟乙烯或不锈钢容器
容器一定要盖严
防止溶剂挥发引起组成变化
防止氧和二氧化碳溶入流动相
不能贮存在塑料容器中
有机溶剂如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增塑剂
磷酸盐、乙酸盐缓冲液很易长霉
现配现用
如确需贮存，需冷藏，3 天内使用，用前应重新滤过
容器应定期清洗，特别是盛水、缓冲液和混合溶液的瓶子
以除去底部的杂质沉淀和可能生长的微生物
数据记录及处理装置
自动馏分收集装置
电脑
仪器使用
注意事项
流动相滤过后，观察有无肉眼可见微粒、纤维须重新滤过。
柱在线时，增加流速应以0.1ml/min 的增量逐步进行，一般不超过1ml/min，反之亦然
否则会使柱床下塌，叉峰
柱不线时，要加快流速也需以每次0.5ml/min 的速率递增上去(或下来)，勿急升(降)，以免泵损坏
安装柱时，请注意流向，接口处不要留有空隙
样品液请注意滤过(注射液可不需滤过)后进样，注意样品溶剂的挥发性
测定完毕用水冲柱1 小时，甲醇30 分钟，若第二天仍使用，可用水以低流速(0.1~0.3ml/min)冲洗过夜(注意水要够量)，不须冲洗甲醇
含碳量高、封尾充分的柱，先用含5~10%甲醇的水冲洗，再用甲醇冲洗
冲水的同时用水充分冲洗柱头(如有自动清洗装置系统，则应更换水)