酶免疫技术

临床免疫学检验中关于酶免疫技术的一个章节，参考来自广州医科大学金域检验学院的PPT课程。

酶免疫分析技术

• 思考题
  • 酶免疫技术的要点？
  • 酶联免疫吸附试验的原理（ ELISA)?
  • 竞争法在酶联免疫检测应用中的原理和应用？
  • 常用的底物有哪几类？特点？常用的酶有哪几类？特点？
  • 何谓包被与封闭？其作用？
  • 常用固相载体的种类和特点？
  • 举例固相酶免疫定应用的原理及影响因素ELISA的常见的分析模式有哪些？
• 类型：测定技术
  • 均相
    • 用于小分子激素和半抗原
  • 异相
    • 固相酶免疫测定
      • ELISA
    • 液相酶免疫测定
  • 区别：异相需要分离游离与结合的酶标记物
• 酶和酶标记物
  • 酶
    • 辣根过氧化物酶HRP
      • 分子量较小，标记方法简单，稳定易保存。廉价易得，底物种类多
      • NaN3可抑制HRP的活性
      • 真正的底物是过氧化氢，DH2是供氢体
        • 邻苯二胺OPD：橙黄色→棕黄色
        • 四甲基联苯胺TMB：蓝色→黄色
          • 见光易分解
    • 碱性磷酸酶AP
      • 用于酶免疫测定时不能使用PBS作为洗涤液
      • 酶活力高但是分子量较大，价格昂贵
      • 常用显色底物：对硝基苯磷酸盐p-NPP
    • β-D-半乳糖苷酶
      • 人类血液标本缺乏此酶故测定时不易受到内源性酶的干扰
      • 用于均相，常用底物：4-甲基伞基-β-半乳糖苷4MUG
  • 制备酶标记物
    • 过氧酸钠氧化法——仅用于HRP标记抗体或抗原
    • 戊二醛交联法——各种酶标
• 酶联免疫吸附实验
  • 流程
    • 包被
    • 反应
    • 洗涤
    • 底物显色
  • 类型
    • 夹心法：常用于检测至少含有两个抗原表位的抗原
      • ※所用两种抗体分别针对同一个抗原分子的不同抗原表位
      • 一步法：简单但容易出现钩状效应——假阴性结果
      • 二步法：双抗体夹心法中类风湿因子（RF）干扰，RF是抗变性IgG的自身抗体，可以与多种变性IgG的Fc段结合，若待测血清中含有较高浓度RF时，可以与固相抗体及晦标抗体发生桥联，产生假阳性反应
    • 间接法：是检测抗体（IgG）最常用的方法
      • 只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体（酶标抗人lgG）建立检测相应抗体的方法。
      • 易受血清中高浓度非特异性IgG的干扰（非特异性gG可以对固相产生吸附从而产生假阳性反应），待测标本需稀释后測定
    • 竟争法：主要用于小分子抗原（半抗原）的测定
      • 竞争的两抗原能力相同
      • 固相抗体位点有限小于两抗原总量
      • 反比
    • 捕获法：是检测lgM类抗体最常用的方法
      • 存在RF干扰出现假阳性结果
  • 技术要点
    • 包被：直接/间接
    • 封闭：消除固相载体表面未结合的位点
    • 确定最佳工作浓度：强阳性OD值0.8左右，阴性OD值<0.1,P/N最大值的包被抗原稀释度