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食品生物技术(五大工程)
下图详细介绍和比较五大工程：基因工程，细胞工程，酶工程，发酵工程，蛋白质工程。
编辑于2020-12-28 10:48:09- 生物技术
- 五大工程
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- 大纲
食品生物技术
生物技术
基础：现代生命科学
植物学、动物学、遗传学、分子生物学、微生物学……
运用：先进的科学原理&工程技术手段
化学/机械/控制/环境工程……
按照：预先设计
加工or改造：生物材料
基因、细胞、有用物、个体or个体的一部分
产出：人类需の产品&达到某种目的
粮食、医药、食品、能源、金属……
与人类健康、农业、资源、能源、环境 有关
影响→伦理，道德，法律
食品生物技术
食品生物技术の概念
is 现代生物技术→应用→食品领域。
基础：现代生命科学の研究成果
结合：现代工程技术手段&其他学科の研究成果
用：全新的方法&手段
设计：新型 食品&食品原料
研究内容(领域)
上游技术
基因工程（核心&基础）
DNA重组技术
对象：基因
细胞内DNA分子上具有遗传效应的特定核苷酸序列の总称
具有遗传效应のDNA分子片段
操作：切→接→转→增→检
获得：新性状、新产品
细胞工程
对象：细胞
操作：培养、增殖、改造 细胞
获得：新性状、新产品、加速培育
研究成果の产业化：通过 发酵工程&酶工程
酶工程
对象：酶
操作：酶的 固定化、分离纯化 及 改造
获得：酶制剂
发酵工程
微生物工程
对象：微生物
真菌、细菌、放线菌……
操作：发酵培养
获得：产品产物
蛋白质工程
对象：蛋白质
DNA→RNA→蛋白质
操作：对应基因 的 修饰&合成 →蛋白质 定向改造
获得：具有 优良特性 的蛋白质分子
食品生物工程下游技术
食品生物技术与食品安全的关系
发展简史
第一代生物技术产品——远古时代
啤/果酒，酱，醋，接种痘苗预防天花，发酵面包……
第二代生物技术产品——巴斯德时代
抗生素，酶，乙醇，维生素，生物杀虫剂，青霉素……
现代生物技术的崛起
基因工程药物、基因治疗、转基因植物、克隆动物、DNA芯片……
※ 传统与现代生物技术的区别
传统
利用现有的 生物类型或生物机能
“大自然的恩赐”
现代
按照人们的意愿，创造全新的生物类型
“索取”
研究进展
食品资源の改造
抗病/虫/除草剂/旱性……
速生高产生物
具有特殊品质的基因工程生物
食品加工过程&食品品质の改造
改善食品微生物的生产性能
实现重要产品的高水平、低成本の生产
提高发酵食品质量&使加工过程更加合理
应用于食品酶制剂的生产
凝乳酶：第一个应用于食品の基因工程酶
植物食品基因工程进展
蛋白质/碳水化合物/油脂/贮藏保鲜 工程
动物食品基因工程进展
转基因
发酵工程在食品工业中的应用
微生物菌体发酵
微生物酶发酵
微生物品代谢产物发酵
微生物的转化发酵
生物过程细胞的发酵
现代生物技术の前景展望
基因工程
基因
概念
DNA分子上 具有 遗传效应 の 特定核苷酸序列
指导 人体重要物质 蛋白质 等的合成，维持 人体的 正常生理功能
物质层面：染色体上的一段脱氧核糖核酸(DNA)序列。
功能层面：遗传信息的载体，编码蛋白质和核糖核酸(RNA)分子功能，调控基因表达。
核酸
分类
脱氧核糖核酸 （DNA）
细胞核、线粒体、叶绿体、质粒……
遗传信息的载体
核糖核酸 （RNA）
细胞质、细胞核
分类
核糖体RNA（rRNA）
核糖体的成分
转运RNA（tRNA）
转运氨基酸
信使RNA（mRNA）
传递DNA的遗传信息，指导蛋白质合成
化学组成
元素组成：C、H、O、N、P
分子组成：
碱基
嘌呤碱
嘧啶碱
螺旋の内侧
戊糖
核糖（U）
脱氧核糖（T）
磷酸
螺旋链の骨架
基本单位：核苷酸
发展简史
孟德尔：豌豆实验
发现遗传规律：同对因子分离，异对因子自由组合
首次提出“遗传因子”（即 基因）
摩尔根：果蝇实验
基因在染色体上
遗传的基因链锁 &互换定律
沃森&克里克：DNA双螺旋结构模型
DNA右手双螺旋结构
DNA复制机制：半保留复制
基因工程
诞生の基础
理论上の三大发现
遗传信息的携带者是DNA，不是蛋白质【肺炎双球菌转化实验】
DNA分子的双螺旋结构模型 & 半保留复制机制
中心法则 & 操纵子学说 及 遗传密码的破译
理论基础
所有生物DNA的基本结构是一样的，不同基因具有相同的物质基础，因此基因可以重组互换
基因可切割和转移，保证了基因工程能对基因操作而不会影响其功能
遗传密码是通用的，多肽与基因之间存在对应关系，而不受物种局限
基因可通过复制把遗传信息传递给下一代。
技术上の三大发明
DNA分子の体外切割与连接技术
基因工程载体的使用
DNA分子の徐磊分析、琼脂凝胶电泳、杂交技术……
1937年：基因工程诞生元年
概念
指用 酶学方法 将 异源基因 & 载体DNA 进行 体外重组，将 形成的重组DNA 导入宿体细胞，使 异源基因 在 宿体细胞 中 复制表达，从而达到 改造受体生物品种或性状，大量生产出 人类所需的生物品种和产物，
也称：分子克隆 or 重组DNA技术。
主要内容
从生物有机体基因组中，分离出带有目的基因的DNA片段。
将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子。
将重组DNA分子转移到适当的受体细胞(寄主细胞)并与之一起增殖。
从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞，并筛选出已经得到扩增的目的基因。
将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，生产出人类所需要的物质。
基本过程
五大基本操作单元：切、接、转、增、检
分离出 含目的基因 的DNA
限制性内切酶 截取DNA片段（切）
从 大肠杆菌 中分离出 质粒 并 酶切（切）
连接酶 连接 酶切的目的基因&质粒（接：DNA重组）
切、接：DNAの体外重组
把 重组质粒 引入 宿主细胞（转）
克隆 目的基因，筛检 后 表达（增、检）
检：转化子の 筛选&鉴定
转、增：重组DNA分子 の 转化&扩增
任何生物的基因→与其毫无关系的任何其他受体细胞
某一段DNA→受体细胞内 复制→制备大量纯化のDNA片段
四大要素
工具酶
目的基因（制备）
基因载体
基因受体
DNA
分类
染色体DNA
获取 目的基因
质粒DNA
载体
病毒、噬菌体DNA
构建 克隆载体、分离目的基因&基因表达调控因子
线粒体叶绿体DNA
获取 目的基因
提取
准备 生物材料
DNA含量丰富，含杂质少
质粒DNA
菌液培养→对数生长期后期
植物DNA
幼嫩部位or幼苗，减少 淀粉/糖分の积累→干扰提取DNA
动物DNA
去除 酶活性高 の部位
裂解 细胞
裂解适度，避免DNA链断裂
原核生物：溶菌酶、超声波、NaOH、SDS处理 or煮沸、冷冻处理
真核生物：粉碎→同上
分离&纯化 DNA
裂解后の细胞液 → ＋蛋白质变性剂[酚/氯仿/异戊醇/ SDS……]（蛋白质变性）→ 离心（去除蛋白质等杂质）→ 有机溶剂[乙醇/异丙醇]（聚集沉淀DNA）→ 除去溶液 → 粗DNA → 进一步纯化[酚/氯仿：抽提，70％乙醇]
检测：凝胶电泳 技术
原理
迁移率
电泳分子 电场中 の 迁移速度
与 电场强度&本身净电荷 成正比
与 介电分子的摩擦系数 成反比
DNA骨架本身带负电荷，在电场中 向正电极移动；
不同DNA 分子量大小&构型 不同 → 电泳迁移率 不同 → 不同 区带。
将 蛋白质or核酸分子 混合物中各成分 分离。
类型
琼脂凝胶电泳
“小、广”：分离度：较差 ；分离范围：优于
聚丙烯酰胺凝胶
凝胶浓度越 高，孔隙越 小，分辨能力越 强。
工具酶
限制性内切酶
概念
底物：环形or线形 双链 DNA
识别：特殊核苷酸序列
断开：（适合的反应条件）每条链的特定の 磷酸二酯键
产生：3'-OH 和 5'-P基因 の DNA片段
内切脱氧核糖核酸酶
种类
Ⅰ型酶
识别位点 很远处 任意切割，特异性差，需 辅助因子
Ⅱ型酶 ✓
识别位点 中/临近の确定位点 特异地切开，专一性强，识别&切割序列一致，无需辅助因子or只需Mg2+
Ⅲ型酶
识别位点 之外 切开，识别位点is反向重复序列，无规律，很少产生完全切割的片段
命名原则
构成：菌系编号、菌株名、分离顺序
属名の首字母大写 种命の前两字母小写 分离顺序(罗马字母)
作用机制
识别序列
限制性内切酶 在 双链DNA 上 能够识别の 特殊核苷酸序列
同分子中 短，出现几率大
作用方式
酶切特点
识别长度
4~8对碱基
切割位置
识别序列の内部or两侧
识别结构
回文结构
酶の类型
稀切酶
同裂酶
识别序列 相同
同尾酶
识别序列 不同，but得到 相同 黏性末端
切割方式
黏性末端（交错切开）
5'黏性末端（5'短）
3'黏性末端（3'短）
平整末端（平齐切割）
反应系统
反应底物（DNA）
内切酶用量（活力决定）
反应缓冲液（最适PH7.5）
适当温度（大部分37℃）
酶切鉴定：凝胶电泳 技术
DNA连接酶
概念
催化：DNA分子中 相邻の 3'-OH和5'-P 末端之间
形成：磷酸二酯键
即 可：封闭双链DNA上 相邻 核苷酸 之间の单链缺口。
主要の两种
大肠杆菌-DNA连接酶
黏性末端，需辅助因子：NAD
同种限制酶or两种同尾酶
T4-DNA连接酶
黏性末端、平整末端，需辅助因子：ATP
同种or两种限制酶
非互不黏性末端、非平整末端の连接
核酸外切酶
平整末端
末端核苷酸转移酶
修饰成 互补黏性末端
碱性磷酸酶
将5'-P修饰成5'-OH，防止载体自我环化
DNA主要连接方式
同种内切酶→黏性末端
同尾酶→黏性末端
不同 黏性末端
切平、补平
人工黏性末端——5突出'末端
补平
人工黏性末端——3突出'末端
人工黏性末端——平头末端
黏性末端の更换
其他工具酶
DNA聚合酶
PCR扩增
反向转录酶
构建 cDNA文库
T4多聚核苷酸激酶
S1核酸酶
目的基因の制备
目的基因
概念
☞已被/欲被 分离、改造、扩增和表达 の 特定基因/ DNA片段，能编码某一产物/性状
又称：特意基因or靶基因
来源
真核生物 染色体 基因组（人&动物）
原核生物 染色体
质粒、病毒
线粒体、叶绿体……
方法
直接分解法
原理
染色体DNA→限制内切酶：切割→所有片段 链接→某载体→转入大肠杆菌→增殖→适当方法筛选→含目的基因の重组体菌落→提取DNA→酶切→获得 目的基因。
对象
原核生物基因组较小，基因容易定位，或已知核苷酸序列的DNA分子。
优点
快速简便、产物纯度高。目的基因
基因文库法
原理
某种生物基因组の全部遗传信息→克隆载体→贮存：一种受体菌克隆子群体（这种生物的甚因组文库）。
包含某种生物基因组 全部基因の受体菌群体 称为：该生物の基因组文库
化学合成法
已知序列信息时，获取目的基因 最方便的方法！
PCR扩增法 （聚合酶链式反应）
实质
体内DNA复制の体外模拟
原理
循环
变性
94℃
加热/碱性，DNA双链→氢键断裂→单链
退火
55℃
模板&引物の复性
延伸
72℃
特定のDNS序列：几何指数增长
PCR反应过程/反应步骤
模板DNA的变性
模板DNA加热至94~95℃一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；
模板DNA与引物的退火（复性）
模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
引物的延伸
DNA模板-引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。
PCR反应体系
反应缓冲液
底物：dNTP（4种脱氧核苷酸：dATP、dGTP、dTT、dCTP）
引物×2
模板：DNA分子
Taq酶（DNA聚合酶）
Mg2+（酶的辅助因子）
PCR特点
灵敏度高
特异性强
简便、快速、重复性好
对标本的纯度要求低
载体
基因载体の概念
将 外源DNA或目的基因 带入 适当宿主细胞 の 工具or运载体
载体应具备の条件
相对分子质量较小，宜于接受目的基因；
能在宿主细胞内进行独立和稳定的自我复制，当外源DNA插入后仍能保持稳定的复制和遗传特性。
能给宿主细胞（受体）提供可选择标记，有可供辨认的表形特征，便于筛选；
在其DNA序列中有适当的单一的限制性内切酶切点，该位点位于DNA复制的非必需区内，即经某限制性内切酶切割后，即可把质粒DNA闭环打开接纳外源DNA片段，又不会丢失自己的片段。
质粒
概念
双螺旋闭环DNA分子
独立于染色体之外 进行 复制&遗传，又依赖于 宿主编码の酶&蛋白质 来进行 复制&转录
Vs 染色体
都与 生物遗传 有关
化学本质不同
染色体：蛋白质&DNA
质粒：DNA
类型
严紧型
只有一份拷贝，or最多只有几分拷贝
松弛型
常用质粒载体
大肠杆菌 质粒载体
两个抗生素抗性基因
乳糖操纵子：lacZ基因→β半乳糖苷酶→水解 X-gal（lacZ蓝-白斑筛选）
质粒DNAの提取
选择性抽提
在较温和的条件下，用溶菌酶溶菌，形成的细胞碎片因染色体DNA和质粒DNA有相对分子量上的差异，用高速离心方法分离。相对分子量较小的质粒DNA留于上清液，经乙醇沉淀得到质粒DNA粗制品。
碱性SDS法
在pH12.0-12.5范围内使染色体中双螺旋开链DNA选择性变性，而闭环双链DNA不变性。经乙酸钠中和后，SDS引起蛋白质-SDS复合物和相对分子质量高的DNA 沉淀，再经高速离心将质粒DNA留于上清液中而分离。
质粒DNAの纯化
碱性蔗糖密度梯度离心法
染色体双螺旋开链DNA易变性，而闭环双链质粒DNA不易变性，在蔗糖浓度梯度中质粒DNA沉降速度大于变性DNA而分离纯化。
氯化铯-溴化乙锭( Et-Br)密度梯度离心法
染色体双螺旋开链DNA易和染料Et-Br结合而密度降低，质粒DNA由于紧密闭合而不宜结合，密度大，经离心分离。
硝酸纤维素膜吸附法
硝酸纤维素膜吸附单链DNA，染色体DNA易变性形成单链，而与质粒DNA分离。
改造构建
删除 非必需区
加入 新的遗传标记基因
引入 具有多种限制酶识别及切割位点のDNA序列，即 多克隆位点
λ噬菌体
噬菌体
不能脱离宿主细胞而自行繁殖，只能在活体细胞中生长 & 对宿主细胞有严格の专一性
主要类型
插入型载体
替换型载体
其他载体
基因重组
概念
目的基因&载体：体外结合→重组子。
重组方式
以 黏性末端 为主
直接黏接
简单、高效
加尾黏接
利用 末端核苷酸转移酶 在 DNA末端 制造 黏性末端
主要工具酶：T4-DNA连接酶（5'-P和3'-OH）
DNAの重组
① 同种内切酶生产的粘性末端的连接
② 同尾酶生产的粘性末端的连接
③ 不同粘性末端的连接
④ 人工粘性末端的连接（5’突出末端、3’突出末端、平头末端）
⑤ 粘性未端的更换
重组率=含有外源DNAの重组分指数 / 载体分子数 ，常规实验条件：25~75%
基因の转化&表达
目的基因导入受体细胞
宿主细胞(受体细胞)
概念
转化、转导&杂交中 接受 外源基因DNA 导入的细胞
is重组体 扩增の场所
类型
原核生物细胞
大肠杆菌、枯草杆菌
真核生物细胞
酵母（主要）
特点
单细胞
非致病菌，安全
感受态
感受态
宿主细胞 能吸收 外源DNA分子 而 有效作为 转化受体の某些生理状态。
取决于
受体细胞自身の生理状态
重组DNA分子の构型&大小
一般 宿主细胞 在 对数生长期：转化能力 Max
感受态细胞
能 摄取 外界DNA分子 の 生理状态の细胞。
转化
Ca2+诱导の完整细菌细胞の转化
电穿孔 转化
转化率
概念
影响因素
扩增检筛
扩增
筛选方法
根据 载体抗生素抗性基因&相应的选择药物 筛选
带 双抗生素抗性标记の质粒载体 转化 大肠杆菌 の筛选方法
载体：Amp(抗氨苄biàn青霉素)、Tet(抗四环素)
外源基因插入其中一个抗生素抗性基因导致其失活
两种抗生素平板 筛选 重组子
步骤
①正选择
含 未插入失活抗性基因对应的抗生素
转化子√
不含靶基因的质粒の转化子 √
含靶基因的重组子の转化子 √
非转化子×
②负选择
含 插入失活抗性基因对应的抗生素
不含靶基因的非重组子转化子√
含靶基因的重组子の转化子×
两培养基对比→挑选：含靶基因的重组子の转化子
利用 乳糖操纵子lacZ基因(蓝白斑) 筛选
具有 完整乳糖操纵子の菌体能 翻译LacZ基因 编码β-半乳糖苷酶 → 水解X-gal→蓝色
外源基因插入→LacZ基因不能表达→白色
需：未插入失活の抗生素抗性基因 → 氨苄青霉素 培养基
不含靶基因的质粒の转化子：菌株 蓝色
含靶基因的重组子の转化子：菌株 白色
应用 DNA芯片 鉴定重组子
许多特定的DNA寡聚核苷酸/DNA片段(探针)→固定：芯片の预设位置
待测样本：标记→与芯片杂交（碱基互补配对原则）→检测 杂交信号&计算机分析
根据 目的基因翻译产物(蛋白质、酶、多肽) 筛选 【无 标记基因or无法合成 探针】
蛋白质凝胶电泳法
PAGE
免疫检测法
酶联免疫吸附法
蛋白质印迹法
免疫沉淀法
固相放射性免疫测定法
目的基因の表达
在食品工业中的应用：转基因食品
转基因微生物食品
定义
工程菌
特点
应用
(1)提高食品产品的品质
(2)简化生产工艺，缩短生产周期
(3)食品的抗菌和防腐保鲜
(4)食品级酶制剂生产菌的改良
(5)保健食品功效成分的生产
(6)食品微生物的快速检测
转基因动物食品
涉及类型
主要应用
改变家畜生成速度;
改善乳产品的营养组分，特别针对婴幼儿
通过生物反应器生产人血清蛋白等。
转基因植物食品
定义
类型
应用
改善食品原料の品质
改进食品生产工艺
生产食品添加剂&功能性食品
酶工程
酶の化学本质
一类 由 活细胞产生の、具有催化活性作用&高度专一性 の 特殊蛋白质，
又称：生物催化剂
酶工程
概念
又称：酶技术
利用酶的催化作用，在一定的生物反应器中，将相应的原料转化成所需要的产品的过程，是酶学理论与化学工程相结合而形成的一门科学技术。
分类
化学酶工程 （初级酶工程）
自然酶
化学修饰酶
固定化酶
人工合成酶
生物酶工程 （高级酶工程）
酶学&以基因重组技术为主的现代分子生物学技术 结合的产物
克隆酶
突变酶
新酶酶
在非水相介质中的催化作用
酶反应器&酶传感器
发展简史
酶の制备&发酵生产
主要途径
从生物细胞内直接提取
化学合成
微生物发酵生产获得 酶
常用の产酶微生物
细菌
放线菌
霉菌
酵母菌
……
用于食品酶制剂の细胞 应具备の条件
安全可靠、非致病菌
稳定性好，不易退化，不易感染噬菌体
酶产量高，有较好的开发应用价值
容易培养和管理，产酶细胞易生长繁殖
能利用廉价的原料，发酵周期短
发酵方法
固体 发酵法
液体 发酵法（主要）
间歇(分批)发酵法
连续发酵法
工艺条件&控制
条件
培养基
温度
pH
溶氧量
发酵时间
原则
（先）利于 菌体生长→最适条件
（再）不影响 酶の形成→酶生产の需要
提高酶产量の方法
基因重组技术 选育 优良细胞
强化 生产过程
控制 合理 发酵条件
pH、温度、基质浓度……
添加 底物/底物相似物/前体物质
如：异丙基-β-D巯基半乳糖 → β-半乳糖苷酶产量增加1000倍。
控制 阻遏物 浓度
产物积累一定浓度，合成受阻。
添加 表面活性剂
主要是 非离子型表面活性剂。
添加产酶促进剂
植酸钙镁、聚乙烯等。
酶の分离纯化
细胞破碎
机械 破碎
原理
机械运动：剪切力→组织、细胞破碎。
方法
捣碎法
研磨法
匀浆法
物理 破碎
原理
各种物理因素→组织、细胞の外层结构破坏→细胞破碎。
方法
温度差
压力差
超声波
化学 破碎
原理
各种化学试剂→细胞膜→细胞破碎。
方法
有机溶剂
苯甲、丙酮、丁醇、氯仿
表面活性剂
Triton、Tween
酶解 破碎
原理
细胞本身酶系 or 外加酶制剂 の催化作用→细胞外层结构 破坏→细胞破碎。
方法
自溶法
外加酶制剂法
提取
纯化
透析
蔗糖梯度溶液
离心
基本原理：不同浓度の蔗糖溶液，蛋白质分子 相对分子量不同→沉降速度不同→高速离心→酶&蛋白质：沿浓度梯度→各自の区（每个区带只含一种酶/蛋白质）
酶の分子修饰
概念
改变 酶分子の结构→酶的某些性质&功能发生改变
主要方法
化学修饰
概念
化学手段→将某些化学物质/基团结合到酶分子上，或将酶分子的某些部分删除/置换，→改变酶的理化性质→改变酶催化性质的目的。
方法
大分子结合修饰
大分子：氢键（非共价作用）/共价连接→酶分子表面→保护层→稳定性↑
侧链基团修饰 （小分子修饰）
小分子 共价修饰酶→酶表面の一些基团
分子内or分子间交联
双/多功能试剂→酶更稳定
戊二醛
二亚胺
肽键有限水解修饰 （酶蛋白主链修饰）
肽链の限定肽键位点：水解→酶空间结构：改变→改变 酶特性&功能
氨基酸置换修饰 （活性基团修饰）
选择性修饰 氨基酸侧链成分→改变 氨基酸の取代→改变 活力中心の氨基酸→改变 酶的特性
金属离子置换修饰
酶分子中の金属 取代→改变 酶的专一性、稳定性 及其抑制作用
物理修饰
概念
物理方法→不改变酶の组成单位&基团，只使酶分子的空间构象发生改变(副键变化或重排)→改变酶的某些特性和功能。
方法
高压处理
酶活提高
最适条件改变
适当变性 改变 空间构象
稳定性适当提高
酶の固定化
酶的固定化の概念
酶&不溶性载体→结合→使 游离酶、细胞或细胞器等的催化活动 完全或基本上限制在一定空间内的过程。
固定化后的酶：仍具有酶的催化活性，能连续进行反应，并且反应后的酶可以回收重复使用。
方法
吸附法
吸附方法
物理吸附
氢键、疏水作用、π电子亲和力 → 酶 固定于 水不溶载体
载体
有机载体
淀粉、谷蛋白、纤维、甲壳素……
无机载体
活性炭、多孔玻璃/陶瓷、氧化铝、硅胶……
代表性酶
α-淀粉酶、糖化酶、葡萄糖氧化酶
特点
吸附容量较低
（一般<1mg蛋白/g吸附）
酶活力损失少
与载体结合力较弱，易脱落
离子吸附
适宜pH&离子强度 → 酶の侧链解离基团 & 含有离子交换基团の水不溶性载体 → 静电作用力→结合
载体
阴离子交换剂
阳离子交换剂
代表性酶
β-淀粉酶、糖化酶、葡萄糖异构酶、DEAE-Sephadex固定化氨基酰化酶
特点
优点
操作简单，处理条件温和，可以得到 较多 高活性的固定化酶；
可充分选择 不同电荷、不同形状 的载体，
吸附过程 可以 同时纯化酶，
固定化酶在使用过程失活后可 重新活化，同时载体可以 回收再利用。
缺点
吸附法制备的固定化酶 易脱落，影响产物纯度&操作的稳定性。
包埋法
一定方法 → 酶 包埋于 半透性の载体
包埋方法
凝胶 包埋法
酶或含酶菌体 包埋在各种 凝胶内部的微孔中 ，制成的固定化酶/固定化菌体。
常用凝胶
琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂等。
特点
条件温和，对酶活影响小，但强度差。
半透膜 包埋法
又称：微胶囊包埋法，指将 酶分子 定位于 半透性の聚合体膜内 ，制成微胶囊型酶。
常用半透膜
聚酰胺膜、火棉胶膜、硝化纤维、聚苯乙烯、壳聚糖等。
特点
微胶囊大小可控制、胶囊化时间短、酶与底物接触表面积大、多种酶可固定于同一胶囊，利于多酶固定。
特点
优点
操作简单，
只被包埋，未化学反应→较高活力的固定化酶，
对大多数 酶、粗酶制剂，甚至 完整の微生物细胞 都是适用的。
缺点
只有小分子底物&产物可以通过凝胶网络，而对大分子底物不适宜。
凝胶网络对物质扩散的阻力 导致固定化酶动力学行为的变化、活力降低。
共价键结合法/共价偶联法
酶蛋白の侧链基团 & 载体表面の功能基团→共价键结合
与 载体共价结合の酶功能基团
氨基、酚基、咪唑基、巯基、羟基、吲哚基等
载体
天然有机载体（纤维素、琼脂糖）
合成高聚物（尼龙、多聚氨基酸）
无机载体（多孔玻璃、金属氧化物）
结合方法
重氮化法、烷基化法、芳基化法、缩合反应、叠氮反应、巯基-二琉基交换法、金属偶联反应等。
特点
优点
结合牢固，不易脱落，利于连续使用。
缺点
载体活化操作复杂，
且制备过程中酶直接参与化学反应，易引起酶结构变化，使固定化酶活力降低或破坏，回收率低(约30%)。
交联法
双/多功能试剂 → 在酶分子之间 or 酶与载体间 or 酶与惰性蛋白间→交联反应
常用交联剂
戊二醛、双重氮联苯胺-2,2-二磺酸……
交联反应
酶浓度高→发生在：酶分子之间
后：不溶态
酶浓度低→发生在：酶分子内部
交联方法
直接交联法
戊二醛溶液 → 酶溶液 → 不溶性固定化酶
酶辅助蛋白交联法
双/多功能试剂 → 惰性蛋白&酶→交联
载体交联法
双/多功能试剂の一部分功能基团&载体→交联， 另一部分功能基团&酶蛋白→交联
吸附交联法
酶 吸附于 吸附剂（硅胶、皂土、氧化铝 等）→ 与 双功能试剂 交联
特点
结合牢固，可长时间使用；
但条件剧烈，酶活损失大，
固定化酶颗粒小，使用不方便。
改进
于 吸附法/包埋法 结合使用
固定化酶
优缺点
优点
易于将酶与底物及产物分离，因而产物相对容易提纯；
能够重复利用，使用效率提高，成本低；
大多数情况下可以提高酶的稳定性；
可以增加产物的收率，提高产物质量；
有利于实现管道化、连续化以及自动化操作，易于与各种分离手段联用
缺点
特别固定化过程中酶的活力难免有一定损失；
只适用于水溶性的、小分子底物；
与完整菌体相比，不适用于多酶反应，是需要辅助因子的反应。
性质
活力：通常会降低↓
原因
构象改变
立体屏蔽效应
稳定性：通常会提高↑
热稳定性↑
pH-酶活力 关系
反应的最适pH&酶活力-pH曲线 ：变动 ←依据： 酶蛋白&载体の电荷
载体
带负电荷
最适pH：向 碱性 方向移动
带正电荷
最适pH：向 酸性 方向移动
对蛋白酶的抵抗力提高↑
蛋白酶分子量大，无法进入固定化酶中
对变性剂、抑制剂的抵抗能力提高↑
操作稳定性↑
可长期使用
半衰期较长
贮藏稳定性↑
原因
固定化 增加酶构象の牢固程度
抵挡 不利因素对酶の侵袭
限制 酶分子间の相互作用
在食品工业中的应用
改进啤酒生产工艺，提高啤酒质量
固定化生物催化剂酿造啤酒新工艺
固定化酶用于啤酒澄清
添加蛋白酶&葡萄糖氧化酶，提高啤酒稳定性
+蛋白酶：提高啤酒稳定性
+葡萄糖氧化酶：提高啤酒稳定性&保质期
葡聚糖酶 提高啤酒的持泡性
大麦→β-葡聚糖：过多→难过滤、浑浊；沉淀
降低啤酒中 双乙酰含量
改进工艺，生产 干啤酒
改进果酒果汁饮料的生产工艺
果汁 提取、澄清、过滤
食品保鲜
酶法保鲜
葡萄糖氧化酶
除氧保鲜
蛋类制品の脱糖保鲜
溶菌酶
利用固定化酶生产 高果糖浆
酶法生产 新型低聚糖
低聚果糖
异麦芽寡糖
α-葡萄糖苷酶→
低聚半乳糖
酶法生产 环状糊精
环状糊精の作用
使易挥发、氧化和光分解的物质稳定化
改变物质的理化基础
改变被包接络合物分子的反应性能
酶法应用于干酪制品的生产
凝乳酶
蛋白质工程
蛋白质
生理功能
催化功能
酶
调节功能
激素
结构功能
细胞骨架
运输功能
血红蛋白
免疫功能
免疫球蛋白
运动功能
鞭毛、肌肉蛋白
储藏功能
酪蛋白
生物膜功能及神经传导等
人类生活中的の重要性
维持生命所必须の基本物质。
用蛋白质 诊断&治疗某些疾病。
食品工业应用蛋白质 制造各种产品。
实际应用の局限
发挥功能 要在：生理条件下
蛋白质工程
概念
对 现有蛋白的分子结构 or 对编码蛋白质的基因 → 改造or全新设计 蛋白质→ 获得适合人类需要的新型蛋白质产品。
食物蛋白质改性技术
蛋白质の功能特性
水合特性
溶解性
分散性
溶胀性
增稠性
乳化特性
乳化性
发泡性
持水性
持油性
流变&质构性能
胶凝性
黏附性
弹性
概念
化学、物理、生物(酶) 手段 → 本质上改变蛋白质の功能特性→食品所需的品质特性。
方法
化学 改性
针对：氨基、羟基、巯基&羧基→化学修饰→改变蛋白质の结构、静电荷、疏水基团→改变基功能性质。
酶法 改性
酶法 水解 改性
蛋白酶→降解：食物蛋白→改善：溶解性、分散性、乳化性。
酶法 聚合 改性
转谷酰胺酶→蛋白：聚合改性→提高食物蛋白の功能性质。
物理 改性
各种物理场效应→改变蛋白质の功能特性。
如
组织化挤压改性
高压静电改性
高热高压改性
超声改性
高频电场改性
微波改性
……
技术手段
蛋白质水平
化学 改性
酶法水解or聚合 改性
物理 改性
改造 现有蛋白
基因水平
理性分子设计&定位突变
理性分子设计
概念
在已知蛋白质三维结构与功能的基础上，对一段最可能影响蛋白质功能与性质的基因序列进行定位突变，有目的地改变蛋白质的某一两个氨基酸残基或模块，从而构建新的蛋白质分子。
基本步骤
分离纯化 目的蛋白，使之结晶，了解其 空间结构 尽可能多的信息。
确定 它の功能域。
分析 结构&功能 之间の相互关系，找出 关键の结构&基团。
围绕这些关键の基团&结构→提出对蛋白质进行改造の方案 & 用 基因工程の方法(定位突变)→实施。
对 经过改造の蛋白质 → 功能性测定、定位突变。
定位突变
概念
按 理性分子设计の方案 → 已知编码蛋白のDNA序列 → 取代、插入or删除：选定の核苷酸。
常用技术
寡核苷酸引物介导の定位突变
原理
含 突变碱基の寡核苷酸片段→引物 →聚合酶 作用→启动DNA分子→复制
包括
Kunkel突变法
基于 抗生素の“抗性恢复”突变法
基于 去除 特定限制酶切点 の突变法
优缺点
优点
保真度比重组PCR突变法高
缺点
操作环节复杂，周期长
克隆待突变基因时会受到限制性酶切位点的限制
PCR介导の定位突变
原理
PCR→插入&缺失の突变碱基→引物→两对引物→核酸：PCR扩增→重叠延伸→有部分重叠序列の两个PCR产物→混合、变性、复性和链延伸→一对与 两个待接片段 外侧互补 の引物→第二次扩增→全长の异源杂合双链DNA。
优缺点
优点
操作简单
突变成率100%
缺点
保真率偏低
后续工作复杂
盒式突变
原理
又称：片段取代法
目标基因序列：适当 限制酶切位点→插入：各种合适の突变DNA片段→取代：目标基因中特定DNA片段。
包括
盒式取代诱变
混合寡核苷酸诱变
优缺点
优点
简单易行
突变效率高
次改变多个位点或一个片段
缺点
合成DNA片段成本高
要求合适的限制内切酶位点
应用：酶结构 改造
增强 稳定性↑
提高 酶活力↑
改变 酶の选择性
消除 酶の抗氧化性
引入 二硫键
转化 氨基酸残基
改善蛋白质の热稳定性
改变 酶の最适合pH值条件
盒式突变→葡萄糖异构酶分子
修饰 酶の催化特异性
定点突变技术→葡萄糖淀粉酶
体外定向进化
非理性分子设计
理论来源
利用基因工程原理→实验室：模拟生物进化过程。
概念
蛋白质の体外定向进化：又称 分子进化，
就是：实验室条件 → 模拟自然进化机制：对编码蛋白子の基因 → 诱变、重组 → 高通量筛选 → 选择出性能更加优良的蛋白质。
不需：已知蛋白质的结构信息
随机突变+定向选择=目标突变体
Vs 自然进化
进化动力不同
进化方向不同
进化速度不同
VS
定向进化
突变位点：随机、不确定，& 数目：不确定
突变效应：不可预知
定点进化
突变位点：确定，& 个数：预知
突变效应：可能是已知的
随机突变体の获得方法 （常用の定向进化技术）
重组
DNA 改组
一群密切相关的DNA序列→ DNaseI→随机酶切→许多片段→部分重叠碱基序列→自身引导PCR重组→全长基因→多样性文库→筛选突变文库→改良的突变体→下一轮模板→重复多次 重排&筛选→获得性状满意の突变体
原理
外显子 改组
随机体外引发 改组
合成 改组
突变
容错PCR
Taq聚合酶→目的基因のPCR扩增，同时 引入碱基 错配→目的基因 随机突变
原理
随机定位突变
交错延伸
……
应用：酶制剂 改造
L-天冬氨酸酶：提高酶耐热性&酶活
磷脂酶A1突变体：耐有机溶液
乙内酰脲酶：D-型底物 突变成 L-型底物
融合蛋白技术
概念
有目的 → 把 两段/多段 编码功能蛋白の基因编码区 → 首尾连接 在一起 → 同一调控序列：控制 所构成の基因表达产物→表达所需の蛋白。
方法
PCR介导の蛋白质分子嵌合体的形成
内含子介导の蛋白质分子嵌合体的形成
连接酶直接连接
应用
双功能酶
保留 所构成的酶分子各自の酶活性
可产生：“邻近效应”
靶向药物/定向药物
组成
药物
可与病灶特异性结合の配基
可构成：具有 独特构想&功能の蛋白质
抗菌肽
肽类抗生素
机体天然产生 / 天然免疫の重要组成部分
对 耐药菌 有强大 抗菌作用
一类 阳离子 小分子 多肽，具有 广谱抗菌活性
全新蛋白设计
概念
根据 所希望得到の 蛋白质结构&功能 → 设计 氨基酸序列，
称：反折叠研究
需要了解：蛋白质结构&功能之间の关系
基本步骤
提出基本结构图样
确定氨基酸顺序
结构优化
取得的进展
创造全新蛋白质
基因水平の蛋白质工程 の三个层次
初级改造
个别氨基酸的改变
一整段氨基酸序列的删除、置换or插入
高级改造
蛋白质分子の剪裁
如：结构域の拼接，融合蛋白技术
从头设计合成 新型蛋白质
列举3例 蛋白质工程在食品中の应用
引入二硫键 → 改善蛋白质的热稳定性
转化氨基酸残基 → 改善蛋白质热稳定性
改变酶的最适pH值条件 → 提高玉米中赖氨酸の含量
细胞工程
概念
利用 细胞生物学&分子生物学技术 ， 应用 工程学 的方法，在 细胞水平 上研究改造 生物遗传特性&生物学特性，从而获得特定の细胞、细胞产品or新生物品种 的一门综合性科学技术。
研究范畴
动物细胞与组织培养
植物细胞与组织培养
细胞融合（体细胞杂交）
单克隆抗体
细胞核移植（细胞拆合）
染色体工程
动物
植物
胚胎工程
干细胞与组织工程
细胞生物反应器
应用
植物细胞工程
种苗脱毒&快速繁殖
脱毒：脱去病毒，不是脱去毒素
基础研究
体细胞杂交
体细胞融合产生远缘杂种
植物特殊倍性创造
多倍体
三倍体培养
胚乳培养
单倍体
花药培养
花粉培养
次生产物生产
培育植物新品种
动物细胞工程
疫苗生产
乙型肝炎表面抗原基因→插入 哺乳动物细胞→高效表达→乙型肝炎疫苗
生产单克隆抗体
检测出多种病毒中非常细微的株间差异→鉴定细菌的种型&亚种
繁育优良品种
人工受精、胚胎移植等技术→畜牧业生产
干扰素生产
细胞培养
概念
动物、植物&微生物 细胞→体外 无菌→生长、分裂&繁殖，并 在培养过程中不再形成组织。
植物细胞培养
发展
细胞学说
施莱登&施旺
植物受伤愈合组织の皮层能产生芽
细胞全能性学说
一般步骤
取材&除菌
消毒酶菌剂：次氯酸钙、次氯酸钠、氯化汞……
配置培养基→灭菌/除菌→无菌操作→将生物材料接种于培养基中
培养基放入培养箱→提供各类细胞生长所需の最佳培养条件→细胞达到一定量，及时收获/传代
培养基
通常包括：无机盐、碳源、维生素、生长调节素、有机添加剂……
碳源和能源
蔗糖 & 葡萄糖。
维生素
硫胺素（培养中的植物细胞都需要）
烟酸、泛酸、生物素、叶酸
氨基酸
L-谷氨酰胺、蛋白酶解产物。
植物生长激素
生长素
吲哚乙酸 & 萘乙酸
分裂素
6-苄氨基腺嘌呤 & 玉米素
外植体
植物组织培养：离体培养 の 植物材料。
愈伤组织
外植体 → 组织增生の细胞 → 一团 不定型の 疏散排列の 薄壁细胞，是分化的 & 未形成组织 の 结构。
诱导
选择适宜的 外植体
幼胚、下胚轴、子叶
选择适宜的 培养基 （MS、B5、N6）
较高の激素浓度
丰富の有机附加物
较高含量の无机氮源
较低の蔗糖浓度
适当 缩短 继代培养 の 间隔时间
有利于疏松易碎愈伤组织的形成。
悬浮培养
适宜悬浮培养の要求
松散性好、增殖快、再生能力强.
外观一般is色泽呈鲜艳の乳白/淡黄色，呈细小颗粒状，疏松易碎.
VS 适宜 再生植株
绿色
高表达细胞系の筛选建立
悬浮培养物 分散性好、外观疏松、色泽鲜艳
均一性好
生长速度快、次生代谢产物合成能力强
单细胞培养技术
单细胞 分离方法
机械法
研碎→过滤&离心→收集&净化
优点：不受酶的伤害，利于细胞生理&生化研究。
缺点：手工操作难度大，获得完整的细胞数量少
酶法
果胶酶、纤维素酶
+渗透压保护剂：甘露醇→以防酶对细胞的损伤
+硫酸葡聚糖钾盐→提高游离细胞的产量
化学法
草酸钙→胡萝卜悬浮细胞培养
秋水碱、2，4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）/ LH（促黄体生成素）
单细胞 培养方法
看护培养
一块 活跃生长の愈伤组织 → 促进 培养细胞 持续 分裂&增殖
优缺点
优点：简单易行、效果好
缺点：不能在 显微镜 下 追踪细胞分裂、生长 过程。
平板培养
悬浮单细胞&融化的琼脂培养基→混合→平铺一薄层在培养皿底上
p
优缺点
优点：
分布均匀→便于 显微镜：细胞 定点观察
筛选效率高、筛选量大、操作简便
缺点：通气状况不好，排泄物质易积累→毒害/影响组织吸收。
微室培养
人工制造 无菌小室 ： 一滴悬浮细胞液 → 培养在少量培养基上→分裂增殖→细胞团
优缺点
优点：可对培养细胞 连续进行显微观察→了解一个细胞の生长、分裂、分化等过程。
缺点：培养基少，营养和水分难以保持，pH变动幅度大，培养细胞仅能短期分裂。
植物细胞の 保存
继代培养 保存方法
低温 保存方法（5-10℃）
超低温 保存方法
植物细胞 大规模培养
在食品工业中的应用
利用植物细胞工程 生产香料
生产 食品添加剂
生产 天然食品
特点
植物细胞对剪切力敏感。
植物细胞培养通常形成细胞团。
植物细胞生长速度慢，操作周期长
多泡沫。
植物细胞在高浓度培养时为假塑性流体。
植物细胞的需氧量要比微生物要低的多。
大多数植物细胞培养需要光照。
悬浮培养
把 离体の植物细胞 悬浮在 液体培养基 中进行 增殖培养。
生物反应器
机械搅拌反应器
优点
最大优点：高的溶氧量
较易控制：温度、pH、溶氧、营养物质
缺点
剪切力问题
单位体积消耗的功率 比 气体搅拌 大
搅拌轴→无菌密封
非机械搅拌反应器 常为：气体搅拌器
气升式反应器
外循环式
内循环式
鼓泡式反应器
优缺点
优点
剪切力小
易保持无菌
操作费用低
缺点
高度密封培养时→混合不够均匀
过量 通气→易排除 培养液中の CO2 & 乙烯
过高 溶氧→不利于 合成 次级代谢产物
优势
1)培养细胞与培养基质接触面大，传质效果好。
2)可带走有害的代谢产物，避免了有害产物局部浓度过高的问题。
3)能充分保证氧的供给。
固定化培养
将植物细胞→包裹：一些多糖/多聚化合物→培养 & 生产有用代谢物。
生物反应器
填充床反应器
流化床反应器
膜反应器
优势
(1)有利于次生物质的合成、积累；
(2)减弱剪切力损伤；
(3)有利于连续培养&产物收集。
动物细胞培养
概念
动物机体→取出相关组织→分散→单个细胞→适宜培养基→生长增殖&维持功能和结构。
原代培养
动物组织消化后の初次培养。
传代培养
胰蛋白酶→接触抑制の贴壁细胞→培养瓶壁上 脱离 → 细胞悬液 → 分装→多个培养瓶中→继续培养の过程。
细胞系
初次培养の细胞 经 第一次传代成功后。
细胞株
从一个经过生物学鉴定の细胞系→用 单细胞分离培养 or 通过筛选 方法，由单细胞增殖 形成の细胞群。
有限细胞系
在体外的 生存期有限，即 不能 长期传代 の细胞系。
无限细胞系
在体外 可以 持续生存，具有 无限繁殖能力 の细胞系。
生长特点
贴附生长
粘附型细胞
附着在 某一固相支持物表面 才能 生长の细胞。
绝大多数有机体细胞
悬浮型细胞
不必附着于 固相支持物表面，悬浮状态下 即可 生长の细胞。
肿瘤细胞、白细胞
接触抑制
细胞：贴壁生长→细胞间 相互接触→细胞 分裂&生长 停止 の现象。
肿瘤细胞：无
密度抑制
细胞密度增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多→营养枯竭&代谢物の影响→细胞分裂&生长停止
形态
类型
上皮细胞型
形态
类似体内的上皮细胞，扁平，不规则多角形，中有圆形核。
生长特点
彼此紧密相连 成 铺石状薄层；生长时呈 膜状移动；很少脱离细胞群 而 单个活动。
成纤维细胞型
形态
胞体梭形or不规则三角形；胞质向外伸出2—3个长短不等的细胞突起；中有卵圆形核。
生长特点
排列成 放射状，漩涡状，不连成片。
游走细胞型
形态
外形不规则且不断变化，细胞内容易出现暗的吞噬性颗粒。
生长特点
生长位置 不固定，分散，呈 活跃の游走&变形运动。
多型性细胞型
形态
外形不规则，细胞由略呈多角形的胞体和细长的、类似伪足的胞突两部分组成，胞内容易出现暗的吞噬性颗粒。
变化の影响因素
血清
pH
细胞密度
生长状态改变
转化与否
培养细胞の生长&增殖过程
生命期
细胞在 培养基中 持续增殖&生长の时间。
包括
原代培养
传代培养
衰退期
一代生存期-生长曲线
”一代“：从细胞接种到分离再培养的一段时间。
包括
潜伏期
指数增长期
平衡期
衰退期
基本技术
无菌、无毒的环境
添加一定量的抗生素，定期更换培养液。
温度和pH
温度与体内相近 35-37℃
pH 7.2~7.4 。
气体环境
O2（细胞代谢所需）
CO2（维持pH）
CO2培养箱（95%O2+5%CO2）
营养成分
糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素、激素以及动物or人血清……
平衡盐溶液BSS
人工合成培养基的基础用液
用来 洗涤细胞。
动物细胞 大规模培养
方式
分批式
流加式
半连续式
连续式
技术
悬浮培养
贴壁培养
固定化培养
微载体培养技术
大载体培养技术
多孔载体培养
微囊化培养技术
中空纤维细胞培养技术
细胞融合技术
概念
外力作用 → 两个以上の异源(种、属)细胞or原生质体 → 互相接触 → 不经 有性过程 → 膜融合、胞质融合&核融合 → 形杂合细胞 の现象。
过程
细胞→促融因子→凝集现象→质膜粘连→细胞质融合→核融合→杂种细胞。
诱导方法
病毒诱导细胞融合
仙台病毒、新城鸡瘟病毒、孢疹病毒……
最早采用の融合剂：病毒
常用于：诱导 动物细胞融合
需先用 紫外线 or β-丙内酯 灭活。
机制：病毒黏结作用
优缺点
优点
融合率较高，适合各种动物细胞
易培养
缺点
仙台病毒 不稳定
制备过程较繁琐
病毒引进细胞后Maybe 干扰 细胞の生命活动
化学融合剂法
聚乙二醇（PEG）诱导法
机制：改变 各类细胞の膜结构→两细胞相互接触部位の膜脂双层中脂类分子发生疏散&重组
优缺点
优点
使用方便
融合频率较高
缺点
有一定毒性
卵细胞 不适用
NaNO3 处理诱发融合
机制：Na+造成膜电位改变
缺陷：融合率低；对来源叶肉的高度液泡化的原生质体有害。
高pH-高浓度钙离子 处理
烟草叶肉原生质体
电诱导细胞融合法
原理：极化成偶极子
步骤
① 电泳
② 融合
优缺点
优点
融合率高
可显微镜下定向诱导细胞融合
可直接挑选杂种细胞
重复性强、对原生质体伤害小
装置精巧、方便简单
免去PEG诱导后的洗涤过程
诱导过程可控性强
缺点
必须购置专用の细胞电融合设备
激光诱导细胞融合
光镊の原理
均匀电场
非均匀电场
光镊 牵拉、辅助
离子束诱导细胞融合
细胞表面被刻蚀 → 通透性&跨膜电场 改变
原生质体
概念
特殊方法→去除 细胞壁→裸露的、有生命力の 原生质团。
制备
取材与消毒
取材
可用 各种组织&器官，但多应用 叶片、愈伤组织 & 悬浮细胞；以及 茎尖根尖、子叶 & 胚性组织。
消毒
肥皂水—70%酒精—3%次氯酸钠—无菌水。
原生质体の分离
机械 分离法
高渗糖溶液：预处理→轻微质壁分离→收缩成球形→机械法磨研组织→伤口释放：完整的原生质体
优缺点
优点：可避免酶制剂对原生质体的破坏
缺点：完整原生质体の数量较少
酶解 分离法
等渗酶液：降解细胞壁→保温一定时间
优缺点
优点：获得量大，适用广泛
缺点：影响原生质体の活力
原生质体の纯化
漂浮法
优点：可避免分离の原生质体 因震荡 被组织碎片撞击 而 破损；所用药品简单，成本低。
缺点：对 离心力要求 比较严格；掌握不好，原生质体则 不易漂浮。
沉降法（过滤-离心法）
优点：简单
缺点：引起破碎
不连续梯度法
两种密度不同の溶液→形成不连续梯度→离心→原生质体&破损细胞→不同液相。
优点：可获数量较大の纯净原生质体；同时避免收集过程中原生质体质体带因相互挤压而 破碎。
洗涤
原生质体培养液
鉴定
低渗溶液
活力测定
形态识别
荧光显微镜识别法（FDA法）
FAD不发荧光，不具极性，能自由穿过细胞质膜；被活细胞の内酯酶水解→荧光素（不能自由穿越质膜）。
√ 活细胞：发荧光
酚藏花红染色法
√ 无活力の原生质体：红色
伊凡蓝染色法
√ 死细胞 & 有活力但受损：染色
融合子の鉴别
显微鉴定
根据 两亲本 原生质体の 形状&结构 の差异 →鉴别杂合体。
如：基本无色+绿色→白绿色：杂合细胞。
荧光标记
根据 可见标记性状 の 机械选择法。
FITC(异硫氰酸荧光素)在荧光显徽镜下呈绿色，
RITC(异硫氰酸罗丹明)在荧光显徽镜下呈红色
互补选择法
利用 两个亲本 具有 不同の遗传&生理特性→特定培养条件→只有发生 互补作用の杂种细胞 才能生长。
代谢互补
利用 两种营养缺陷型/两种抗性突变体 の 原生质体 进行融合，在 同时缺陷两种物质/同时含有两种有害物质の培养基上 筛选 杂种细胞，能生长の细胞团 可以初步认为由 杂种细胞 形成。
生长互补
双亲原生质体の生长 需要 外源生长激素，而 由双亲原生质体融合后 形成 对生长激素自养の杂种细胞，能在 无外源生长激素の培养基上 生长。
细胞拆合技术
胞质体
除去 细胞核 后 由膜包裹の无核细胞。由细胞松弛素B处理后经离心得到。
核质体
由 胞质体 分离出来の核，带有 少量胞质 并 围有质膜の结构。
微细胞
核内 染色体 不完整の细胞。
细胞重组
概念
细胞融合技术&细胞核质分离技术→结合→融合介质作用→胞质体&完整细胞 / 胞质体&核质体 / 微细胞&完整细胞→重新构成细胞の过程。
三种方式
胞质体p+完整细胞p→细胞质杂交细胞
微细胞p+完整细胞p→微细胞异核体
胞质体p+核质体p→重组细胞
细胞拆合
概念
完整细胞の细胞核&细胞质→特殊方法（紫外线：杀死核/吸取出核）分离→同种/异种の细胞核&细胞质→重新组合→培育新的 细胞/生物个体。
方法
物理 拆合法
机械方法or短波光
化学 拆合法
细胞松弛素
核移植技术
利用 显微操作技术 将一个细胞の细胞核 移植到 另一个细胞中，或者 将两个细胞の细胞核（或细胞质）进行交换，从而可能 创造 无性杂交 生物新品种の一项技术。
发酵工程
发酵
微生物 通过 代谢活动，大量累积 人类所需产物の过程
发酵工程
概念
利用 微生物の生长繁殖&代谢活动，并通过 现代化工技术，大量生产 有用物质の一种生物技术体系。
又称：微生物工程
分类
固体发酵
微生物→湿の固体培养基→生长、繁殖、代谢の发酵过程。
特点
优点
培养基简单，来源广泛
发酵过程不需要严格的无菌操作
通过通风来供氧和温度控制
发酵残渣处理简单
分生孢子可长期保存并且能重复使用。
培养基、菌体生长、对营养物质的吸收和代谢产物的分泌在各处不均匀。
缺点
发酵参数的检测和控制比较困难
难于连续和自动化
劳动强度大、占地面积大、易污染杂菌
液体深层发酵
发展史
自然发酵时期
第一代 微生物发酵技术 ——纯种发酵の建立
转折1：纯种发酵
列文虎克：显微镜→微生物
巴斯德：酒精发酵←酵母
科赫：细菌纯培养 技术
第二代 微生物发酵技术 ——深层培养技术
转折2：通气搅拌技术
青霉素
转折3：代谢控制发酵技术
人工诱变
转折4：发酵原料の转变
最早用 非碳水化合物为原料代粮发酵生产：SCP（单细胞蛋白）
第三代 微生物发酵技术 ——基因工程菌の构建
转折5：基因工程菌の构建
基因工程技术&细胞融合技术
发酵培养基
培养基の类型 （按 用途 分）
斜面培养基
种子培养基
发酵培养基
培养基の制备
碳源の使用
糖蜜
制糖生产时の结晶母液
制糖工业の副产物
较多杂质 → 需 预处理
谷氨酸发酵→预处理脱除 生物素
葡萄糖
所有微生物都能利用
引起 葡萄糖效应
淀粉
可解除 葡萄糖效应
氮源の使用
无机氮源
种类
铵盐
硝酸盐
氨水
特点
微生物吸收快→速效氮
生理酸/碱性物质
无机氮源（氮源）→ 菌体利用 → 微生物生理作用(代谢) → 形成
选择 合适の无机氮源 有两层意义
满足 菌体生长
稳定&调整 发酵过程のpH
有机氮源
来源
成分复杂
提供 氮源
提供 大量无机盐&生长因子
前体物
加入 发酵培养基 → 生物合成过程：直接结合到产物分子 → 产物の产量大幅提高の物质。
丝氨酸：甘氨酸； 青霉素 发酵培养基：+苯乙酸
产物促进剂
非细胞生长所必须的营养物 & 非前体，但 加入后 却能 提高产量の添加剂。
作用方式
生长因子
延迟 菌体自溶
改变 代谢途径
降低 呼吸作用
改善 通气效果
降低 产物浓度
培养基の优化
试验方法
单因子试验
多因子试验
均匀设计
正交实验设计
响应面分析
举例
初步确定可能的培养基成分
通过单因子试验选定适宜的碳源&浓度
通过单因子试验确定氮源、无机盐&浓度
改进后培养基的发酵结果
培养基の灭菌
微生物の热死灭动力学
对数残留定律
培养基：湿热灭菌 → 培养基中の微生物受热死亡(微生物体内蛋白质变性)の速率 & 残存の微生物数量→成正比。
K值（比热死亡速率常数）
影响因素
微生物の种类&存在方式
灭菌温度
K值越大↑，微生物越容易死亡
灭菌程度
微生物残留量：N=10^-3个/罐
灭菌10^3次，存活一个活菌孢子的机会为1次。
灭菌温度 & 灭菌时间
K值&温度の关系
K随温度变化而变化
营养物质 受热破坏の规律
培养基热灭菌→杂菌死亡 & 培养基：不太稳定の成分受热破坏
可看作：一级反应
Kd值&受热温度の关系
分解速率常数Kd值 随物质种类&温度而不同
Eg.维生素 最易被破坏，Kd值最大
菌体热灭死 & 营养物质热破坏の比较
p
活化能 对 反应速度 随温度变化敏感性 の影响
活化能大的反应，反应速度随温度改变也大
活化能非常小的反应，反应速度随温度改变也很小
灭菌动力学の重要结论 ——高温短时灭菌
活化能大的反应中，反应速度随温度变化也大； 活化能小的反应速度随温度变化小；
细菌孢子热死灭反应的△E很高，而大部分营养物质热破坏反应的△E很低；
因而提高灭菌温度会加速细菌孢子的死灭速率，从而缩短灭菌时间；
由于营养成分热破坏的△E很低，温度提高只能稍微增大其热破坏反应速率，但由于灭菌时间的显著缩短，结果是营养成分被破坏量大大减少；
既能：快速灭菌
又能：有效地保存培养基中の营养成分。
操作方式
分批灭菌
过程
升温
保温
降温
都在：发酵罐
灭菌：主要在保温过程中实现
连续灭菌
步骤
加热
加热设施
保温
保温设施
冷却
冷却设施
灭菌：配置好的培养基→向发酵罐等培养基装置运送の同时进行
比较
发酵菌种及其扩大培养
菌种
要求
培养成本不高
培养条件易控制
生长速度快
菌种不易变异&退化
安全，抗性强
选育、保藏和复壮
自然选育
诱变育种
杂交育种
原生质体融合
基因工程技术
见 微生物学、基因工程、细胞工程 部分
菌种の扩大培养
概念
种子扩培の目的
接种量的需要；
菌种的驯化；
缩短发酵时间，保证生产水平。
种子扩培の 类型&方法
静止培养&通气培养
固体培养&液体培养
浅层培养&深层培养
液体深层发酵 种子扩大培养の流程
实验室阶段
不用种子罐×
生产车间阶段
种子培养在种子罐内进行√
微生物发酵 设备
类型
好氧 发酵设备
液体
机械搅拌式
气升式
自吸气式
固体
通风制曲池
堆曲式
厌氧 发酵设备
液体
发酵罐、发酵池
固体
酒窖、发酵缸
机械搅拌通风发酵罐
罐体
碳钢/不锈钢
搅拌器
打碎气泡，加速和提高溶氧；加速养分和热量传递。
挡板
防止液面中央形成旋涡，增强其湍流和溶氧传质。
改变发酵液流向，促进气液结合
消泡装置
发酵液：含蛋白质等发泡物质→发酵：易产生泡沫→发泡严重→发酵液随排气外溢&增加染菌机会。
通气发酵生产中の 两种消泡方法
①+化学消泡剂
②机械消泡
轴封
罐顶/罐底 & 轴 之间の缝隙 → 密封，防止泄露 & 污染杂菌
联轴器
上下搅拌轴 → 牢固の刚性联接
空气分布装置
吹入 无菌空气，并使 空气 均匀分布
换热装置 （热交换器）
发酵培养基の加热、消毒、灭菌、冷却 & 能够调节发酵过程中の温度
气升式发酵罐（ALR)
内循环式
外循环式
自喷式发酵罐
机械搅拌自喷式发酵罐
喷射自吸式发酵罐
文史管发酵罐
溢流自吸式发酵罐
酒精发酵罐
筒体
发酵罐
冷却装置
洗涤装置
新型啤酒发酵设备
锥形罐
朝日罐
联合罐
发酵工艺控制
温度の中间控制
引起发酵温度变化の因素 ——发酵热
发酵热
发酵过程中释放出来的净热量。
产热因素
生物热
概念
生产菌 在生长繁殖过程中 本身产生大量の热。
影响因素
菌株
对营养物利用速率越大，产热越多。
培养基成份
成份越丰富，产热越多
发酵时期
对数生长期产热量大
发酵类型
好氧发酵比厌氧发酵产热多。
空气带走的热量。
罐壁向外散失的热量。
搅拌热
由于搅拌器搅拌产生の热量。
散热因素
蒸发热
液体蒸发带走的热量。
通气时，引起发酵液的水分蒸发，水分蒸发所需的热量
显热
显热很小，一般可以忽略不计。
辐射热
辐射热的大小 取决于 罐温&环境の温差。
冬天大一些，夏天小一些，一般不超过发酵热的5%。
p
发酵过程中の热量の计算方法
(1)测定一定时间冷却水流量和进出口温度
(2)通过发酵液的温度升高进行计算
(3)根据化合物的燃烧值计算
温度 对 微生物发酵 の影响
温度 对 微生物生长の影响
不同微生物的生长对温度的要求不同。
温度↑ → 微生物の生长&繁殖↑ → But 酶失活の速度↑ → 菌体衰老提前→发酵周期缩短 → 对发酵生产：极为不利。
微生物 受高温の伤害 比 低温の伤害 大，
超过最高温度，微生物很快死亡；
低于最低温度，微生物代谢受到很大抑制，并不马上死亡。
温度 对 产物形成の影响
产物形成反应速率
适合微生物生长の温度 不一定是 适合产物形成の温度
产物合成的方向
温度 影响 发酵液の物理性质
氧の溶解度
菌体 对一些基质の分解吸收の速率
最适发酵温度の选择&控制
最适发酵温度
最适于 某种生产菌の生长 / 产物合成 の温度。
控制
根据 不同的菌种 选择
微生物种类不同，所含酶系及其性质不同
根据 生长阶段 选择
发酵前期：稍高温
中期：温度稍低
后期：提高温度
因 通气条件不同 而改变
通气条件差：最适发酵温度可能比良好通气条件下低一些
根据 菌生长状况
生长快：维持高温时间短些
生长慢：维持高温时间长些
考虑 培养基の成分&浓度
培养基稀薄：成分较易利用：温度可低一些
溶氧の中间控制
细胞 对 氧 の需求
氧
构成细胞本身&其代谢产物的组分之一
直接参与一些生化反应
不同微生物种类 对氧の消耗&敏感度 不同
比耗氧速率（呼吸强度）
单位质量の干细胞 在单位时间内 消耗氧の量 molO2 /(kg干细胞·s )
临界溶氧浓度
当培养基中 不存在 其他限制性基质 时，不影响 好氧性微生物 生长繁殖(呼吸)の最低溶氧浓度。
培养基の组成成分&浓度 影响 细胞の耗氧速率
碳源种类
碳氢化全物类型の碳源 作培养基时 消耗的氧≈碳水化合物の三倍
基质の浓度
细胞の摄氧量 与 培养时间&细胞浓度 有关
摄氧率
指单位体积培养液在单位时间内的消耗氧的量，单位为 molO2 /m3·s
有害代谢产物の积累→抑制细胞呼吸作用
溶解氧浓度 对 细胞生长&产物形成 の影响 可能是不同的
影响 氧传递速率の主要因素
空气中氧分压
通过在通气中掺入纯氧or富氧，或增大罐压可提高氧的饱和浓度C＊
提高
通气流量
通气量↑ → 空气的线速度↑ → ↑氧传递系数KL 。
过大の空气线速度 → 搅拌叶轮桨叶不能打散空气 → 气流形成的大气泡在轴的周围溢出 → 搅拌效率&溶氧量 都大大降低。
搅拌速率
is提高溶氧系数の行之有效的方法。
Why？
① 搅拌能把大的空气泡打碎成小气泡，增加了氧与液体的接触面积，而且小气泡的上升速度要慢，相应地氧与液体的接触时间也就增长。
② 搅拌使液体作涡流运动，使气泡不是直线上升而是作螺旋运动上升，延长了气泡的运动路线，增加了气液接触时间。
③ 搅拌使发酵液呈湍流运动，从而减少气泡周围液膜的厚度，减少液膜阻力，因而增大了溶氧传质系数。
④ 搅拌使菌体分散，避免结团，有利于固液传递中的接触面积的增加，使用权推动力均一，同时也减少了菌体表面液膜的厚度，有利于氧的传递。
空气分布管 类型
空气分布管の形式、喷口直径及管口与罐底距离的相对位置：对氧溶解速率有较大的影响。
培养液粘度
培养液的粘度增大，传质阻力增大，氧传递速率下降。
表面活性剂
培养液中消泡用的油脂等 具有亲水端&疏水端の表面活性物质→分布在气液界面，增大了传递的阻力。
离子强度
一般在电解质溶液中生成的气泡比在水中小，有较大的比表面积。
同一条件下，电解质溶液的KLα 比 水 大。
菌液浓度
随微生物生长，发酵液中细胞浓度增加，KLα 值变小。
控制溶氧の工艺手段
改变通气速率
在低通气量的情况下，增大通气量以提高溶氧浓度有十分显著的效果。
在空气流速已经很大的情况下，再增加通气速率，作用便不明显，反而会产生某些副作用。
改变搅拌速度
一般来说，改变搅拌速度的效果要比改变通气的效果好。
当转速较低时，增大转速效果明显，
当转速已经很高时，增大转速不仅会使消耗功率增大，还会由于搅拌的剪切作用，打碎菌丝体，促进菌丝自溶并减少产量。
改变气体组成的氧分压
通入纯氧的方法来改变空气中氧的含量，提高C*值，从而提高供氧能力。
改变罐压
实际上就是改变氧的分压来提高C*，从而提高供氧能力。但此法不是十分有效。
改变发酵液的理化性质
加消沫剂，补加无菌水，改变培养基成分。
加入传氧中间介质
血红蛋白；烃类碳氢化合物（煤油、石蜡、甲苯与水等）；含氟碳化物。
发酵过程中 pH值の影响
发酵过程 PH变化
一般规律
生长阶段
初期：pH较稳定
快速生长期：pH变化较大
生产阶段
pH趋于稳定
自溶阶段
pH上升
原因
基质代谢
糖代谢
糖被分解成小分子酸、醇，pH下降。
糖缺乏，pH上升：补料的标志之一。
氮代谢
氨基酸中-NH2被利用：pH下降；
尿素被分解成NH3，pH上升，NH3被利用后pH下降；
碳源不足时，氮源当碳源利用：pH上升。
生理酸/碱物质的代谢
被利用后，PH下降/上升。
某些产物的形成
有机酸类 产生：使pH下降
红霉素、洁霉素、螺旋霉素等抗生素呈碱性：使pH上升。
菌体自溶
发酵后期，pH上升。→终止发酵的指示。
通气、染菌等
PH变化 对发酵の影响
微生物の生长繁殖
酶的活性
影响 细胞膜所带电荷→ 改变 细胞膜的通透性
培养基中 某些营养成分&中间产物の解离。
微生物の形态
代谢产物の形成的数量&方向
产物の稳定性
发酵过程中 最适pH值の选择&控制
选择原则
利于微生物生长
最大限度的获得高产
微生物细胞生长&代谢产物形成の最适pH值
各类微生物 适应のpH范围
酵母菌：3.8-6.0
霉菌：4.0-5.8
细菌：6.5-7.5
放线菌：6.5-8.0
微生物生长阶段 & 产物合成阶段の最适pH值：往往不同
菌种の特性→
产物の化学性质→
pHの控制
调节好基础料C/N，pH并使其有很好的缓冲能力。
维持pH的物质：CaCO3
具有缓冲能力的试剂：磷酸缓冲液
通过补料调节pH
补糖速率
NH2-N低&pH低：补 氨水；NH2-N低&pH高：补 (NH4)2SO4
尿素 作为氮源
当补料与调pH发生矛盾时，加酸碱调pH
调通气量，改变温度，罐压等，作为应急措施
现代生物技术与食品安全
转基因食品 GMF
概念
转基因生物→制造、生产：食品、食品原料、食品添加剂……
主要指：转基因植物→食品
广义の转基因食品
使用转基因生物制造、生产の食品
使用转基因生物制造、生产の食品原料
使用转基因生物制造、生产の食品添加剂
使用转基因生物制造の农药所生产の食品
类型
增产型
控熟型
高营养型
保健型
加工型
新品种型
安全性
争论
问题の体现
人类健康
直接影响
营养成分、毒性、过敏性
间接影响
基因片断 导入→基因突变/改变代谢途径→新成分/改变现有成分含量
抗药性、传染性、将有害基因传给人类
生态环境
农业&生态环境
超级杂草
抗虫转基因作物 → 害虫免疫&遗传：超级害虫
向非目标生物 ：基因漂移
使用后畸形/灭绝
破坏生物多样性
问题症结
转基因技术 不成熟
产品品质安全 不确定
转基因技术 对人类社会经济影响 の 不可预见性
评价
目的
为 科学决策 提供依据
保障 人类健康 & 生态环境安全
回答 公众疑惑
促进 国际贸易，维护 国际权益
促进 生物技术 可持续发展
实质等同性 原则
某种新食品/新食品成分 与 已经存在的某种食品/成分 在 实质上相同，那么在 安全性 方面，前者可与后者 等同处理（即：新食品与传统食品同样安全）
基本内容
绝对安全 ；相对安全 √
分析比较
表型性状
分子特征
关键营养成分&抗营养因子
有毒物质
过敏源
转基因食品 → 分3类
实质等同性
安全，无需评价
除引入的新性状外，具有实质等同性
仅评价 转基因产物&其催化产生的物质
不具有实质等同性
全面分析 新食品的营养性&安全性
评价 食品安全 最有效の途径
主要内容
过敏性评价
毒性评价
《食品安全性毒理学评价程序与方法》
营养成分&抗营养因子分析
抗生素抗性标记基因评价
非期望效应の分析
对生态环境可能造成の影响
管理
美国：宽松
欧盟：严谨
中国
最早の法规：《农业转基因生物安全管理条例》
《农业转基因生物安全评价管理方法》《农业转基因生物进口安全管理方法》《农业转基因生物标识管理方法》
检测
基于 核酸の PCR检测技术
PCR技术
运用化学手段对DNA提取
设计并合成引物
进行PCR扩增
克隆并筛选鉴定PCR产物
DNA序列分析
样品采集
原料物质
“三层五点”随即法
加工产品
产品稳定性
采样量
代表性、均匀性；检测の灵敏度&有效性
DNA提取
总DNA
细胞内各种DNA总称
基本原理
样品→释放 & 纯化DNA
去除杂质→高品质
蛋白质
多糖
脂类
RNA
盐类
DNA的 提取&纯化 方法
苯酚—氯仿法
苯酚
破坏 细胞&核酸酶
氯仿
使 蛋白质变性，有助于 液相&水相分离
异戊醇
消除 抽提过程中出现的泡沫
SDS法
侧重：细胞的裂解 & DNA的释放
不适宜：多糖含量高的样品
二氧化硅法
侧重：DNA纯化
不适合：高脂物质
CTAB法 （溴化十六烷基三甲基胺法）
原理
CTAB：去污剂，溶解细胞膜&与核酸形成复合物
高盐溶液
复合物 可溶， 杂质沉淀
低盐溶液
复合物 不溶，杂质不沉淀
离心分离
异丙醇 or 乙醇：使DNA沉淀
主要试剂
CTAB缓冲液
CTAB沉淀液
步骤
CTAB缓冲液
CTAB（裂解细胞膜，释放DNA，并形成CTAB-DNA复合物）→复合物 溶于CTAB缓冲液→离心→上清液（复合物）
三氯甲烷
上清液 ＋三氯甲烷（蛋白质、脂类、多糖、多酚类等：沉淀）→离心→上清液（复合物）
CTAB沉淀剂
CTAB沉淀剂（CTAB-DNA复合物：沉淀）→离心→沉淀（复合物）
高浓度NaCl溶液
溶解沉淀物（复合物可溶于高盐溶液）→ +三氯甲烷（残留的杂质：沉淀）→离心→上清液（复合物）
异丙醇
异丙醇（使 DNA沉淀 & CTAB-DNA复合物分离→去除CTAB）→离心→沉淀（ DNA ）
70%乙醇
漂洗DNA数次（去除：残留盐类&有机溶剂（CTAB、异丙醇、氯仿））→自然晾干（挥发残留的乙醇）
去离子水 / TE缓冲溶液
溶解DNA沉淀
琼脂凝胶电泳&核酸定量检测
检测：DNA质量&含量
定性 PCR检测
PCR技术原理
引物：两对寡聚核苷酸（人工合成）
模板：DNA的两条链
互补结合
Taq聚合酶
底物：4种脱氧核苷酸（dNTP）
合成新链 → 新链为模板，重复，不断反应延伸
被扩增的基因片段 几何指数 增长
步骤
确定 待测目标序列 & 内源参照基因
引物设计
PCR反应体系の构建
PCR扩增
电泳
VS 基因工程：目的基因の制备方法——PCR扩增法
结果分析待测样品
内源参照基因
阴性照样品、阳对照样品、待测样品 均出现相应长度的DNA片段的电泳条带
转基因成分
阴住对照没有相应的电泳条带，阳性对照应出现相应的电泳条带
待测样品
出现相应的电泳条带，表明待测样品含有 转基因成分或确定为何种转基因植物
不出现相应条带，则表明待测样品不含转基因成分
定量 PCR检测
半定量PCR法
实时荧光定量PCR法
原理
PCR反应体系+荧光基因 → 荧光信号 积累→实时监测整个进程→标准曲线→定量分析
分类
荧光探针
TaqMan荧光探针
PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性 将 探针 酶切降解，使 报告荧光基团&猝灭荧光基团 分离→荧光检测系统 可接收到 荧光信号
荧光染料
SYBR GreenⅠ法
SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号
基于 蛋白质の 免疫学检验技术
蛋白质水平
原理
抗原&抗体之间的特异反应（非共价键特异性吸附）
高度特异性，有干扰也可准确识别
方法
蛋白质 印迹法
酶联免疫 吸附法
试纸条法
生物芯片技术
基因芯片技术
大大提高 分析的自动化&速度
降低 成本&污染
基于 现代仪器分析の 近红外光谱&质谱分析技术