内毒素休克小鼠模型的建立与鉴定

这是一个关于内毒素休克小鼠模型的建立与鉴定的思维导图，介绍详细、描述全面、希望能对感兴趣的小伙伴学习提供帮助。

• 内毒素休克小鼠模型的建立与鉴定
  • 建立LPS诱导的内毒素休克小鼠模型
    • 败血症
      • 指致病细菌侵入血液循环中生长繁殖引起的急性全身感染
    • 在革兰阴性菌引起的败血症中，内毒素是最关键的激活因子
    • LPS是内毒素的主要成分，可引起炎症反应
    • 革兰阴性菌感染机体后，释放大量内毒素，作用于机体的巨噬细胞等，诱导细胞活化并产生生物活性物质
    • 活性物质作用于微血管造成功能紊乱，导致微循环障碍
    • 临床表现为微循环衰竭、低血压、缺氧、酸中毒等，严重可导致休克
    • 采用腹腔注射LPS的方式，模拟革兰氏阴性菌感染机体释放大量内毒素导致休克的过程
    • LPS腹腔注射6小时后可作为败血症休克晚期模型
  • 小鼠腹腔巨噬细胞的分离及体外刺激
    • 巨噬细胞表面表达的CD14和TLR4是LPS非常重要的受体
    • LPS通过CD14的转运后，与TLR4结合，启动胞内的信号传导通路，使巨噬细胞从静息状态转变为活化状态，其吞噬功能、杀伤功能、抗原提呈功能和免疫调节功能都得到增强。
    • 腹腔中注射LPS后，腹腔定居的巨噬细胞被LPS激活，成为活化巨噬细胞，并开始分泌多种细胞因子和趋化因子
    • 这些趋化因子和细胞因子可以进一步将外周血中的巨噬细胞细胞趋化至腹腔中，并将其激活
    • 腹腔中会集聚大量处于活化状态的巨噬细胞
    • 腹腔巨噬细胞分离后，在体外用LPS再次刺激时，会在较短时间内释放胞内储存的高水平的IL-1β等细胞因子
  • 小鼠腹腔巨噬细胞总RNA提取及反转录
    • 总RNA的提取
      • 由于RNase A类酶依赖于活性位点处的组氨酸残基起催化作用，因此能被组氨酸烷化剂焦碳酸二乙酯所抑制
      • 从真核细胞分离获得的总RNA，主要包含非编码RNA，如核糖体RNA和转运RNA，以及信使RNA
      • mRNA是蛋白质生物合成的模板，丰度较低，仅占细胞RNA总重量的2%~5%
      • TRIzol法提取动物细胞总RNA
        • TRIzol试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚
        • 异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体裂解，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中，同时高效的抑制RNA酶的活性，从而维持RNA的完整性
        • 氯仿可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后匀浆物可分成透明的上层水相层（含有RNA）、相界面和红色的下层有机层（含有DNA和蛋白质）
        • 异丙醇可从水相层中沉淀出RNA
    • 反转录
      • 以mRNA为模板先反转录生成cDNA，再对cDNA进行PCR扩增
      • 逆转录酶具有三种活性：RNA指导的DNA聚合酶活性，DNA指导的DNA聚合酶活性和RNase H活性
      • 以RNA为模板，以dNTP为底物，在逆转录酶的催化和引物的引导下，合成一条与RNA模板互补的DNA单链，它与RNA模板形成RNA/DNA杂化双链
      • 在逆转录酶的作用下，水解RNA链，再以剩下的单链DNA为模板合成第二链，第二次合成的双链DNA，即为cDNA
  • PCR扩增腹腔巨噬细胞IL-1B基因
    • PCR
      • 变性
        • 模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合
      • 退火
        • 模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合
      • 延伸
        • DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链
    • DNA琼脂糖凝胶电泳
      • 许多琼脂糖链在氢键和其它力的作用下互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。
      • DNA在碱性条件下（pH8.0的缓冲液）带负电荷，在电场中通过凝胶介质向正极移动，不同DNA分子片段由于分子和构型不同，在电场中的泳动速率不同
      • 荧光染料在紫外光的激发下产生荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中从负极向正极泳动时，荧光染料从正极向负极移动
  • ELISA检测巨噬细胞培养上清中IL-1B的含量
    • 用纯化的兔抗鼠IL-1β抗体包被微孔板，制成固相抗体，在包被单抗的微孔中加入小鼠巨噬细胞培养上清
    • 加入生物素标记的兔抗鼠IL-1β抗体，形成抗体-抗原-生物素抗体复合物，洗涤后加入亲和素-辣根过氧化物酶复合体，洗去过剩的标记物，此时固相上酶的量与标本中受检物质的量呈正比例关系
    • 加入酶反应底物ABTS，酶催化底物形成有色产物，可借助酶标仪定量分析产物颜色，从而确定样本中IL-1β量
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