铁死亡表型检测实验

这是一篇关于铁死亡表型检测实验的思维导图，主要内容包括：生化指标验证实验（核心检测项）。阐述了各维度下的实验内容，离子水平、CPX4 - GSH抗氧化、脂质过氧化水平。

铁死亡表型检测实验

• 生化指标验证实验（核心检测项）
  • 铁离子水平
    • 细胞内铁离子含量检测
      • 实验1亚铁离子荧光探针染色
        • FERhoNox-1：特异性结合Fe2+后发出红色荧光
        • Calcein-AM：可被Fe2+淬灭荧光，通过荧光强度变化反应Fe2+含量
        • 方法：细胞经诱导处理后，加入荧光探针孵育，流式细胞仪或激光共聚焦显微镜检测荧光强度。
        • 结果判定：铁死亡组 FeRhoNox-1 荧光强度显著升高，Calcein-AM 荧光强度显著降低
      • 实验2原子吸收分光光度法检测总铁含量
        • 原理：利用原子吸收光谱仪测定细胞裂解液中总铁离子浓度，定量反映铁累积水平。
        • 方法：收集细胞并裂解，酸化处理后上机检测，与标准铁溶液的吸光度对比计算含量。
        • 结果判定：铁死亡组细胞总铁含量显著高于对照组。
  • CPX4-GSH抗氧化
    • 实验 1：细胞内 GSH 含量检测
      • 原理：GSH 可与 DTNB（5,5'- 二硫代双 - 2 - 硝基苯甲酸）反应生成黄色产物，或用荧光探针（如 mBBr）特异性标记。
      • 方法：细胞裂解后，采用比色法或荧光法检测 GSH 浓度，试剂盒操作。
      • 结果判定：铁死亡组 GSH 含量显著降低。 实验
    • 实验 2：GPX4 活性检测实验
      • 原理：GPX4 可催化谷胱甘肽还原过氧化氢或脂质过氧化物，通过检测反应体系中 GSH 的消耗速率反映酶活性。
      • 方法：提取细胞蛋白，加入底物（如过氧化氢、脂质氢过氧化物）和 GSH，检测一定时间内 GSH 的剩余量。
      • 结果判定：铁死亡组 GPX4 活性显著下降
    • 实验 3：GPX4 表达水平检测（Western Blot/RT-qPCR/ 免疫荧光）
      • 原理：铁死亡诱导剂（如 RSL3）可直接抑制 GPX4 活性，或通过下调其 mRNA / 蛋白表达导致功能失活。
      • 方法：提取细胞总蛋白或 RNA，用 Western Blot 检测 GPX4 蛋白水平，RT-qPCR 检测 GPX4 mRNA 水平；或免疫荧光观察细胞内 GPX4 的定位与表达。
      • 结果判定：铁死亡组 GPX4 蛋白 /mRNA 表达显著降低（或活性抑制）。
  • 脂质过氧化水平
    • 实验 1：脂质 ROS 荧光探针染色（如 C11-BODIPY 581/591）
      • 原理：C11-BODIPY 是一种亲脂性荧光探针，正常状态下发出红色荧光；被脂质 ROS 氧化后，荧光峰蓝移，绿色荧光增强
      • 方法：细胞经处理后，加入 C11-BODIPY 孵育，流式细胞仪检测红绿荧光比值，或激光共聚焦观察荧光颜色变化。
      • 结果判定：铁死亡组绿色荧光 / 红色荧光比值显著升高。
    • 实验 2：丙二醛（MDA）含量检测（比色法 / ELISA 法）
      • 原理：MDA 是脂质过氧化的终产物，可与硫代巴比妥酸（TBA）反应生成有色物质，通过吸光度定量。
      • 方法：提取细胞或组织中的脂质，与 TBA 在酸性条件下加热反应，酶标仪检测 532 nm 处吸光度；或用 ELISA 试剂盒直接检测
      • 结果判定：铁死亡组 MDA 含量显著高于对照组
    • 实验 3：4-HNE 免疫荧光 / 免疫印迹检测
      • 原理：4 - 羟基壬烯醛（4-HNE）是脂质过氧化的特异性产物，可通过抗体特异性识别。
      • 方法：细胞爬片经处理后，用 4-HNE 抗体进行免疫荧光染色；或提取蛋白进行免疫印迹（Western Blot）。
      • 结果判定：铁死亡组 4-HNE 的荧光强度或蛋白条带灰度值显著升高。