导图社区 铁死亡表型检测实验
这是一篇关于铁死亡表型检测实验的思维导图,主要内容包括:生化指标验证实验(核心检测项)。阐述了各维度下的实验内容,离子水平、CPX4 - GSH抗氧化、脂质过氧化水平。
这是一篇关于基因实验的方法的思维导图,总结了基因实验中常用的过表达、敲低和敲除KO方法,对每种方法下的具体技术进行了详细说明,并清晰列出了各自的优缺点和适用场景。
这是一篇关于MIRI涉及到的表型的思维导图,主要内容包括:程序性死亡激活,组织与结构层面表型,器官功能层面表型,分子层面表型。
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铁死亡表型检测实验
生化指标验证实验(核心检测项)
铁离子水平
细胞内铁离子含量检测
实验1亚铁离子荧光探针染色
FERhoNox-1:特异性结合Fe2+后发出红色荧光
Calcein-AM:可被Fe2+淬灭荧光,通过荧光强度变化反应Fe2+含量
方法:细胞经诱导处理后,加入荧光探针孵育,流式细胞仪或激光共聚焦显微镜检测荧光强度。
结果判定:铁死亡组 FeRhoNox-1 荧光强度显著升高,Calcein-AM 荧光强度显著降低
实验2原子吸收分光光度法检测总铁含量
原理:利用原子吸收光谱仪测定细胞裂解液中总铁离子浓度,定量反映铁累积水平。
方法:收集细胞并裂解,酸化处理后上机检测,与标准铁溶液的吸光度对比计算含量。
结果判定:铁死亡组细胞总铁含量显著高于对照组。
CPX4-GSH抗氧化
实验 1:细胞内 GSH 含量检测
原理:GSH 可与 DTNB(5,5'- 二硫代双 - 2 - 硝基苯甲酸)反应生成黄色产物,或用荧光探针(如 mBBr)特异性标记。
方法:细胞裂解后,采用比色法或荧光法检测 GSH 浓度,试剂盒操作。
结果判定:铁死亡组 GSH 含量显著降低。 实验
实验 2:GPX4 活性检测实验
原理:GPX4 可催化谷胱甘肽还原过氧化氢或脂质过氧化物,通过检测反应体系中 GSH 的消耗速率反映酶活性。
方法:提取细胞蛋白,加入底物(如过氧化氢、脂质氢过氧化物)和 GSH,检测一定时间内 GSH 的剩余量。
结果判定:铁死亡组 GPX4 活性显著下降
实验 3:GPX4 表达水平检测(Western Blot/RT-qPCR/ 免疫荧光)
原理:铁死亡诱导剂(如 RSL3)可直接抑制 GPX4 活性,或通过下调其 mRNA / 蛋白表达导致功能失活。
方法:提取细胞总蛋白或 RNA,用 Western Blot 检测 GPX4 蛋白水平,RT-qPCR 检测 GPX4 mRNA 水平;或免疫荧光观察细胞内 GPX4 的定位与表达。
结果判定:铁死亡组 GPX4 蛋白 /mRNA 表达显著降低(或活性抑制)。
脂质过氧化水平
实验 1:脂质 ROS 荧光探针染色(如 C11-BODIPY 581/591)
原理:C11-BODIPY 是一种亲脂性荧光探针,正常状态下发出红色荧光;被脂质 ROS 氧化后,荧光峰蓝移,绿色荧光增强
方法:细胞经处理后,加入 C11-BODIPY 孵育,流式细胞仪检测红绿荧光比值,或激光共聚焦观察荧光颜色变化。
结果判定:铁死亡组绿色荧光 / 红色荧光比值显著升高。
实验 2:丙二醛(MDA)含量检测(比色法 / ELISA 法)
原理:MDA 是脂质过氧化的终产物,可与硫代巴比妥酸(TBA)反应生成有色物质,通过吸光度定量。
方法:提取细胞或组织中的脂质,与 TBA 在酸性条件下加热反应,酶标仪检测 532 nm 处吸光度;或用 ELISA 试剂盒直接检测
结果判定:铁死亡组 MDA 含量显著高于对照组
实验 3:4-HNE 免疫荧光 / 免疫印迹检测
原理:4 - 羟基壬烯醛(4-HNE)是脂质过氧化的特异性产物,可通过抗体特异性识别。
方法:细胞爬片经处理后,用 4-HNE 抗体进行免疫荧光染色;或提取蛋白进行免疫印迹(Western Blot)。
结果判定:铁死亡组 4-HNE 的荧光强度或蛋白条带灰度值显著升高。