药物研发基本原理之 安全性和毒理学研究

药物研发基本原理之安全性和毒理学研究，详细梳理了药物研发过程中安全性和毒理学研究的主要内容和技术方法。

安全性和毒理学研究

• 基础概念
  • 安全窗口：产生预期治疗效果的浓度和不产生负面应答的剂量最高浓度的差值
  • 治疗指数：两种计量的比值
  • 化合物未观察到作用剂量：NOEL
  • 最大无毒性反应剂量：NOAEL
    • 最大耐受计量：MTD
• 毒性的来源
  • 靶向毒性(机制毒性)
  • 脱靶毒性
    • 评估靶点临近的亚基
      • 早期体外筛选会开展
    • 重要的酶系
    • 离子通道
    • GPCR等信号通路
    • 有专门机构开展
  • 代谢引起的毒性
    • 代谢酶对候选化合物修饰
    • 候选化合物的代谢产物的毒性
      • 对保护系统如谷胱甘肽的影响
      • 引起机体免疫应答
    • 通过积累的官能团和亚结构的毒性信息库预估代谢产物毒性
      • 芳香硝基：琨-亚胺
      • 杂原子的氧化：曲格列酮的硫原子氧化
      • 伯醇脱氢成醛：阿巴卡韦的伯醇被乙醇脱氢酶氧化
      • 化合物早期设计就避免这些结构的引入
• 急性和慢性毒性
  • 急性毒性：单次给药后产生毒性
    • 很少成药物（偶有例外：三氧化二坤）
    • 通过结合体外和体内的实验确定和排除急性毒性的化合物
  • 慢性毒性：与长期给药有关
• 细胞毒性
  • 定义:化合物杀死原本健康的细胞（
  • 一般原则：除了抗癌药物外，其他药物一般不能有细胞毒性
  • 主要通过体外筛选早期排除此类毒性化合物
    • MTT 人肝毒性检测（同时可检测代谢化合物毒性）
    • 乳酸脱氢酶LDH检测
    • 中性红检测
      • 健康的肝细胞可吸收中性红染料并将其隔离在溶酶体中，通过测定细胞对中性红的吸收评价细胞活力
    • 不能提供MOA，需要更多测试
• 8.4 致癌性 基因毒性和致突变性
  • 致癌性：通过各种机制导致细胞癌变
    • 改变代谢
    • DNA损伤
  • 基因毒性：化合物破坏细胞内遗传信息
    • 单链DNA断裂
    • 双链DNA断裂
    • DNA突变
    • 细胞凋亡
    • 形成肿瘤细胞
  • 致突变性：基因毒性造成的损伤被错误修复，并永久改变DNA遗传信息
  • 现代体外筛选方法能够有效排除
    • 埃姆斯实验Ames assay
      • 监测伤寒沙门菌的生长
        • 伤寒沙门菌没有组氨酸的情况下无法生长，控制组氨酸合成的基因突变会组织细菌产生组氨酸。所以通过最小量组氨酸培养基给与候选化合物后，如果该菌仍然继续生长，说明有潜在致突变风险。 另外可以通过添加给药后大鼠肝脏提取物评价化合物代谢产物的致畸性
    • 微核测试
      • 细胞水平（CHO细胞）识别损害染色体或细胞分裂的化合物
        • 正常的细胞分裂系统遭到破坏时，染色体会发生不均匀的迁移，形成膜结合的DNA片段，称为微核。比正常细胞核小很多。可通过显微镜判断 一般操作：通常所有化合物在与细胞作用一定的时间后，都会有引起染色体损伤的微核产生的可能，在这时间段结束后，加入细胞因子阻断剂如细胞松弛素B，使完成一次核分裂的细胞聚集为双核细胞，对细胞检查并评价微核数量。如果呈现计量依赖性，则该化合物有遗传毒性
    • 染色体畸变实验
      • 基因毒性化合物导致染色体DNA断裂后，错误修复染色体，使染色体结构变化。
        • 细胞给药3h,浓缩的染色体在细胞中央时（M期），添加细胞分裂中期阻断剂，固定细胞，通过显微镜检查评估染色体畸变。
    • 彗星实验
      • 单细胞凝胶电泳SCGE，彗星实验阳性则有遗传毒性
• 8.5 药物-药物相互作用
  • 母体化合物代谢减弱
    • 例如抑制肝药酶CYP3A4的化合物会抑制靠CYP3A4代谢的药物代谢，增加其毒性
  • 母体化合物代谢产物增加
    • 由于另一种化合物抑制母体化合物的良性代谢途径，导致其偏向产生毒性的代谢途径
  • 体外筛选
    • 肝药酶CYP3A4抑制筛选，选择7-苄基-4-三佛甲基香豆素为底物，检测底物转化速率，计算IC50
    • 典型的筛选过程主要评价主要的CYP酶 CYP3A4,CYP2D6,CYP2C9
  • 代谢酶表达水平变化
    • 诱导CYP表达增加
    • 细胞水平筛选
      • 肝脏细胞模型，给予药物刺激，评估细胞对CYP同工酶底物的作用相对对照组的变化
• 心血管安全性
  • hERG通道
    • 心肌细胞动作电位检查
    • hERG FP结合筛选
    • 铷离子流出实验
      • 应用广泛，使用闪烁计数法或者原子吸收法
    • 电生理膜片钳
      • 直接测定，但是无法高通量
  • 现有的已开发的体外筛选平台
    • Millipore
    • Perkinelmer
    • cerep
    • 心血管靶点体外集群
      • 评价药物同这些常见的心血管靶点的相互作用
      • 醛固酮受体
        • α-肾上腺素能受体
        • 血管紧张素能受体
        • β-肾上腺素能受体
        • 内皮素A型受体
        • L型钙通道
      • 盐皮质激素受体
        • 中性内肽酶
        • 烟酸受体
        • 前列腺素E2受体
        • 升压素V1a受体
        • T型钙通道
  • 体内心血管毒性评价
    • 动物实验水平成本巨大，体内心血管安全研究仅限于最有前景的候选化合物
    • 朗根多夫心脏离体灌注模型
    • 实验动物植入遥测设备
• 中枢神经系统安全性
  • 现有的已开发的体外筛选平台
    • Millipore
    • Perkinelmer
    • cerep
    • 评价经典的CNS靶点
      • 腺苷A2受体
      • GABA受体
      • 5-HT受体
      • 去甲肾上腺素转运受体
      • 阿片受体
      • 等等
  • 体内动物模型评价
    • 新物体识别模型
    • 情境恐惧条件反射模型
    • moris水迷宫
• 免疫系统介导的安全性
  • 半抗原-载体蛋白复合物导致机体免疫应答
    • 一般来说，如果化合物和机体内的正常生物分子之间形成了共价键，则有可能引起机体对候选化合物产生免疫应答 例如，形成了半抗原-载体蛋白复合物，青霉素的致敏机制 任何能够与正常蛋白质形成共价键的化合物都可能引发半抗原-载体复合物的免疫反应
  • 免疫抑制作用
    • 免疫系统中重要的环节和靶点被抑制，导致免疫应答水平下降。
    • 体外实验
      • 筛选排除能够抑制关键免疫系统靶点的化合物
• 致畸性
  • 阻止胎儿正常发育的物质
  • 胚胎干细胞测试
    • 成像，活细胞监测小鼠胚胎干细胞像心肌细胞分化的能力-评估收缩肌细胞的数量
    • 酶标仪ELISA测定心肌细胞α-辅肌动蛋白和肌球蛋白含量
  • 斑马鱼测试
    • 鱼类在胚胎发育过程中，对所接触的化学物质敏感性较高
    • 监测受精卵形成到孵化的48~72小时胚胎发育
    • 孵化后持续追踪幼鱼骨骼畸形、游泳及体位等
  • 哺乳动物微团实验
    • 鸡胚，小鼠，大鼠胚胎组织未分化间质细胞分化为软骨细胞的水平
    • 96孔板监测细胞行为：黏附，运动，分裂等
    • 高通量质谱仪监测
  • 体外实验
    • 微孔板酶标仪
    • 活细胞成像
• 体内毒性和安全性
  • 临床前体内毒性试验目的： 预测药物对患者危害 确定I期临床的给药方案 确定临床试验需要监测的毒性和安全标志物
  • GLP实验室的初步体内动物安全研究
    • IND申报必须 至少1种啮齿类动物和1种非啮齿类动物
    • 监测项目涵盖健康各方面
    • 单次递增剂量研究（SAD）：确定MTD，NOEL和NOAEL
      • MTD：最大耐受急性剂量 NOEL:化合物未观察到作用剂量 NOAEL: 最大无毒性反应剂量
    • 2~14周的慢性剂量研究：确定MTD,NOEL和NOAEL
  • IND申报成功后，额外的动物安全性研究
    • 对治疗慢性疾病的药物需要持续3~12个月
    • 拟发现的问题：生殖健康，胚胎发育，免疫毒性，肿瘤学研究