最全荧光蛋白梳理

最全荧光蛋白梳理，荧光蛋白的发现和发展极大推动了当下生命科学的发展，详细梳理了各类荧光蛋白的分类及特点。

荧光蛋白

• 野生FP的历史
  • 20世纪60年代发现GFP
  • 特点
    • 维多利亚发光水母
    • 27kDa
    • 灯笼样结构
    • 发色基团：Tyr Gly Ser
  • 关键科学家
    • Tsien 钱永健
    • 下村修
    • 马丁. 沙尔菲
    • 2008年诺贝尔化学奖，其发现了GFP，他们将死物学变成生物学
  • 改进
    • 提高QE
      • β桶装结构氨基酸残基堆叠
      • 突变发色基团周围的氨基酸残基
    • 适应哺乳动物细胞体系
      • 刚性蛋白质结构
      • 抗pH
      • 抗温度
        • Phe64 -Leu 野生型28° 到37°，
      • 抗变性剂
    • 消除寡聚化
      • 寡聚化影响蛋白定位，例如标记的微管蛋白
      • 影响FRET实验的数据结果
    • 改变光谱性质
      • 突变方式
        • 改变共价键共轭轨道
        • 带电荷氨基酸残基位置
        • 氢键网络
        • 疏水作用
      • FP光谱范围
        • GFP突变覆盖从蓝色到黄色
        • 珊瑚和海葵来源的FP覆盖橙色和红色
• 荧光蛋白及其突变体
  • 色彩斑斓的FP
    • 蓝色FP
      • BFP
        • GFP蓝色突变
        • 劣势：亮度不如GFP
      • EBFP
        • BFP突变
        • 提高了亮度稳定性
        • 劣势：亮度为EGFP一半
      • TagBFP
        • 海葵来源
        • 优势：亮度媲美EGFP
        • 劣势：需要紫外激发对细胞有伤害
        • 良好的绿色FP的FRET供体
    • 青色FP
      • CFP
        • GFP突变
        • 作为黄色FP和橙色FP的FRET供体
      • ECFP
        • CFP突变
        • 提高亮度
      • mTFP1
        • 珊瑚来源
        • 优势：耐酸性，光稳定性高
    • 绿色FP
      • 天然GFP
        • 水母来源
        • 优势：亮度好 耐光性好
        • 劣势：双峰激发光谱，最高激发峰在紫外
      • EGFP
        • GFP突变
        • 优势：最大激发移至488nm 消除双峰
        • 劣势：弱pH敏感性，轻微二聚化趋势
        • 目前GFP变体种亮度最大稳定性最好使用最多的GFP
      • EmGFP
        • GFP变体
        • 优势：光稳定性和亮度最高，成熟速率高
      • 来自珊瑚礁的绿色FP
        • 类型
          • AzamiGreen
          • mWasabi
          • ZsGreen
          • TagGFP
          • superfolderGFP
            • 能够非常有效折叠
            • 与不溶性蛋白结合亮度也很高
            • 更耐酸
        • 劣势
          • 大多数亮度不如EGFP
    • 橙色FP
      • Tag RFP-T
        • 光稳定性最高的FP
      • TagRFP
        • 亮度较高
        • 光稳定性低
      • DsRed
      • mKO
      • mKO2
        • 亮度和光稳定性较GFP弱
        • 成熟快
      • tdTomato
      • mOrange2
      • mFruit家族
        • 适合于构建性能良好的融合蛋白
      • 橙色荧光蛋白常作为FRET受体
      • 子主题
    • 红色FP
      • 自发荧光低
      • DsRed
        • 海葵中分离
        • 四聚体
        • 亮度较暗
      • mRFP1
        • DsRed的单体
        • 光稳定性弱
      • mApple
        • 最亮的红色荧光蛋白
        • 适合于融合蛋白
      • mRuby
        • epFP611改造
        • 适合构成融合蛋白
        • 光稳定性较差
      • DsRed2
        • 珊瑚纲分离
        • 容易形成2聚体
      • 目前红色荧光蛋白的特性都有所缺陷，持续在亮度，光稳定性，单体性方面改进
    • 深红色和近红外FP
      • 近红外光波段（650~900） 是生物组织成像的光学窗口
      • mCherry
        • 亮度只有mApple的一半
        • 适合于融合蛋白
      • mKate2
        • TagRFP改造
        • 亮度更高稳定性更好
        • 588/635
      • mPlum
        • mRFP1的改良
          • 迭代体细胞超变异技术
        • 亮度低 融合蛋白困难
      • TagRFP 657
        • mKate2改造
        • 611/657
      • mNeptune
        • mKate2改造
        • 600/650
      • IFP1.4
        • 2009 Roger Y. Tsien
        • 细菌光敏素筛选
        • 首次将FP的发射波段延申至700
        • 使用时需要外源注射胆绿素，亮度低
      • iRFP
        • 2011 V.V.Verkhussha
        • 细菌光敏素改造来
        • 690/713
        • 无需外源提供胆绿素，亮度稳定
      • Wi-Phy
        • 2012 KTrinaT.Forest
        • 细菌光敏素突变而来
        • 701/719
        • 亮度比IFP1.4弱
      • iRFP670
        • 2013 V.V.Verkhussha
      • iRFP720
        • 2013 V.V.Verkhussha
        • 亮度是IFP1.4的14倍
      • 实现了活体水平肿瘤多色成像
  • 大Stokes位移的FP
    • 特点
      • 激发峰和发射峰之间距离大于100nm
      • 减少多标记应用时的光谱串扰
      • FRET应用时减少激发光对受体干扰
      • 活体成像选择红光大stokes移的减少组织吸收
    • 举例
      • T-Sapphire
        • wtGFP突变
        • 395、509
      • mAmetrine
        • GFP突变
        • 406/526
      • mKeima
        • 首个大stokes位移的红色荧光蛋白
        • 440/620
        • 与CFP联合使用可实现单一光源激发的双色成像
      • mLSS-Kate1/2
        • 基于mKate的单体突变荧光蛋白
        • 463/624 (1) 460/605(2)
        • 优势 成熟时间短、对酸性环境稳定
        • 局限：亮度低，光漂白（红色大stroke通病）
      • mBeRFP
        • 源于mKate
        • 446/611
        • 亮度最大的红色大stokes
        • 成熟速度，耐酸性均较mLSS好
  • 光转换及光激活FP
    • 不可逆型
      • 特点：
        • 仅一次光诱导转换，由暗态变亮或光谱迁移
        • 突变体更多
        • 应用广泛 从超分辨到在体追踪
      • 分类
        • 光激活FP （PA-FP）
          • Photoactivatable fluorescent protein, PA-FP
          • 定义：特定波长的光激发荧光蛋白后，再通过不同波长的激发光才能检测到较强的荧光信号
          • 分类
            • PA-GFP
              • wtGFP突变（T203H）
              • 第一个PA-FP
              • 405nm光激活，激活后488、528连续成像
              • 激活前后FI差100倍
            • PA-mCherry
          • 应用
            • 分子动力学研究
            • 光激活定位显微技术 PALM
            • PA-GFP和PA-mCherry 单分子双色超分辨成像
        • 光转换FP （PS-FP）
          • phtoswitchable fluorescent protein
          • 定义：在一定波长的激光照射后，发射波长发生改变
          • 分类
            • PS-CFP2
              • Em 468 到511
              • 强度增加1500倍
            • Kaede
              • 源于石珊瑚
              • Em 518到582
              • 四聚体，应用局限
            • EosFP
              • 源于石珊瑚
              • Ex390 Em516 到581
              • 单体FP 主要用于超分辨领域
              • mEos3.1/3.2：克服二聚化的EosFP 目前最优秀的
            • Dendra
              • 源于八射海鸡冠珊瑚
              • Em 505到575
          • 应用
            • 转运受体实时动力学特征
            • 超分辨率显微镜
    • 可逆型
      • 定义：被特定波长，强度和照射时间的激发光控制，在亮态和暗态可以转变
      • FP595
        • 最早
        • 由于四聚体问题被淘汰
      • Dronpa
        • 梳状珊瑚
        • 503/518 经过470~510nm光激活后，Dronpa的荧光淬灭 淬灭后暗态可被400nm激光重新激活，可循环
        • 缺点 光转换速度慢
      • Padron
        • Dronpa衍生而来
        • 蓝光活化紫光淬灭
      • bsDronpa
        • Dronpa衍生
        • 紫光活化蓝光淬灭
      • 宽吸收 适合双分子多色超分辨成像
  • 光敏感FP
    • 定义：光照后中心色素团失活，荧光消失，并产生毒性
    • 光毒性产生原理：发色团辅助光失活作用（CALI），产生ROS
    • KillerRed
      • 水螅海蜇
      • EGFP光毒性的1000倍以上
      • 584/610
    • 应用
      • 核酸定点摧毁
      • 定点启动线粒体凋亡
      • 细胞杀伤
      • >10nm的蛋白相互作用研究
  • 计时FP
    • 定义：随着时间变化改变荧光颜色
    • drFP583
      • 从绿变成红
• FP的衍生应用
  • 荧光共振能量转移
    • FRET原理
    • FRET应用
    • FRET探针类型
      • 分子内FRET探针
      • 分子间FRET探针
  • 荧光蛋白双分子互补
    • BiFC原理
    • BiFC应用
    • BiFC量化
    • BiFC限制
    • BiFC展望
• FP的应用
  • 报告型荧光蛋白
    • 蛋白质示踪
    • 细胞/细胞器示踪
    • 基因表达监控
    • 蛋白质降解
  • 功能型荧光蛋白
    • 氧化还原探针
    • ATP探针
    • pH探针
    • 电压敏感探针
    • 离子探针
      • 钙离子
      • 汞离子
      • 铜离子
      • 锌离子
  • 活体肿瘤光学成像
    • 内源标记FP
    • 靶向性FP
    • 展望
  • 小鼠活体免疫荧光
    • 转基因动物模型
    • FP标记病原微生物