生物化学 DNA的合成

这是一篇关于生物化学 DNA的合成的思维导图，该图框架清晰内容详尽，欢迎感兴趣的朋友们参考学习。

DNA复制

• 基本规律
  • 半保留复制
    • 复制时双链解开，分别作为模板合成2条DNA新链
  • 半不连续复制
    • 前导链（复制方向与解链方向相同）连续复制，后随链（复制方向与解链方向相反）不连续复制
    • 冈崎片段
      • 沿后随链模板链合成的新DNA片段
  • 双向复制
    • 原核生物环状DNA：单起点双向复制 真核生物DNA：多起点双向复制
    • 复制叉：复制中的模板DNA形成的2个延伸方向相反的开链区，Y形
    • 复制子：从一个DNA复制起点起始的DNA复制区域，复制的功能单位
  • 高保真性
    • 错配概率极小
• 复制准备
  • 原料
    • dNTP
  • 模板
    • 解开的DNA单链
  • 引物
    • RNA（提供3' -OH末端）
  • 酶
    • DNA拓扑异构酶/拓扑酶
      • 功能
        • 既能水解又能连接DNA中的磷酸二酯键，改变DNA超螺旋状态
      • 分类
        • 拓扑酶I
          • 切断一条单链，适时封闭切口，无需ATP
        • 拓扑酶II/促旋酶
          • 切断正超螺旋的双链，ATP供能下恢复连接
          • 也可解开母链与子链间的缠绕
        • 拓扑酶III
    • 解旋酶/rep蛋白（DnaB）
      • ATP供能解开双螺旋，形成单链
    • 引物酶primase（DnaG）
      • 本质
        • 依赖DNA的RNA聚合酶
      • 功能
        • 催化RNA引物的生成
      • 对利福平不敏感
    • DNA pol
      • 原核生物
        • DNA pol I（最多）
          • 校对、修复、切除引物（RNA酶活性）并填补空隙、切除突变片段（5' -3' 外切酶活性）
          • 结构
            • 小片段
              • 5' -3' 外切酶活性
            • 大片段/Klenow片段
              • 5' -3' 聚合酶、3' -5' 外切酶活性
              • 实验室常用工具酶
        • DNA pol II
          • 校对、应激状态修复
        • DNA pol III
          • 催化DNA聚合（α亚基），延长作用（10种亚基构成的不对称二聚体）
          • 对核苷酸的掺入具有选择功能（ε亚基具3' -5' 外切酶活性，维持保真性）
          • 核心酶：α、ε、θ
          • β亚基：夹稳模板链，使酶滑动
        • 都具有5' -3' 聚合酶、3' -5' 外切酶活性
          • RNA聚合酶、逆转录酶无3' -5' 外切酶活性，错误率高
      • 真核生物
        • DNA pol α
          • 引物酶，合成引物
        • DNA pol β
          • DNA修复
        • DNA pol γ
          • mtDNA合成
        • DNA pol ε
          • 主要催化作用：前导链合成，错配修复（3' -5' 外切酶活性）
        • DNA pol δ
          • 主要催化作用：后随链合成，错配修复（3' -5' 外切酶活性）
      • 总结
        • 需ATP供能
          • 拓扑酶II/促旋酶
          • 解旋酶/rep蛋白（DnaB）
          • DNA连接酶
          • 起始复合物的移动
        • 3' -5' 外切酶活性
          • DNA pol I（大片段/Klenow片段）
          • DNA pol II
          • DNA pol III（ε亚基）
          • DNA pol ε、δ
    • DNA连接酶
      • ATP供能，连接DNA链3' -OH末端和另一DNA链5' -P末端，生成磷酸二酯键
        • 连接缺口，如冈崎片段之间
        • 修复、重组
  • 其他蛋白质
    • DnaA
      • 辨认复制起点
    • DnaC
      • 运送和协同DnaB
    • 单链结合蛋白SSB
      • 维持单链稳定状态，免受核酸酶降解，具有协同效应
      • 不断结合、脱离
• 复制过程
  • 原核生物
    • 共价环状闭合DNA，大肠杆菌为例
    • 1||| 复制起始
      • 1||| 超螺旋的转型
        • 拓扑酶II：正超螺旋--->负超螺旋
      • 2||| 起点固定
        • DnaA结合复制起始点oriC（Dna A结合位点+AT rich区，均为串联重复序列）并相互靠近，促使AT区解链
      • 3||| DNA解链
        • DnaC协同DnaB解链，向解链方向移动，置换DnaA，初步形成复制叉
        • SSB结合DNA单链，一定时间内保持复制叉长度
      • 4||| 引物合成
        • DnaG合成短链RNA引物，提供3' -OH
      • 5||| 起始复合物形成
        • DnaB、C、G，DNA复制起始区域
        • 其移动需ATP供能
    • 2||| DNA链延长
      • DNA pol III催化dNTP转变为dNMP加入子链，前导链先于后随链（同一个DNA pol III）
      • 后随链的模板DNA折叠环绕，对齐前导链延长区域，两链利用同一个DNA pol III
      • 延长中DNA pol I已经开始水解后随链的RNA引物并替换成DNA
    • 3||| 复制终止
      • DNA pol I继续水解后随链的RNA引物并替换成DNA
      • DNA连接酶连接后随链留下的缺口
      • 在环状DNA，前导链RNA引物去除后，继续填补孔隙并连接即可
    • 复制速度与培养（营养）条件有关
  • 真核生物
    • 1||| 复制起始
      • 复制基因：DNA复制起始所必需的全部DNA序列
      • 特点
        • 多起点，同时开始
      • 所需物质
        • 需要DNA pol α、ε、δ，拓扑酶、解旋酶、复制因子RF、增殖细胞核抗原PCNA
          • PCNA
            • 形成DNA夹子，结合于引物-模板链
            • 使DNA pol δ获得持续合成能力
            • 催化核小体生成
            • 检验细胞增殖能力的重要指标
        • 超螺旋转型
          • 拓扑酶
        • DNA解链
          • 解旋酶
        • 引物合成
          • DNA pol α催化引物合成
          • 引物除了RNA，还包括DNA片段，切除引物需要RNA酶、核酸外切酶
      • 步骤
        • 1||| 复制基因的选择（G1期）
          • 基因组的每个复制位点均组装前复制复合物pre-RC，招募基因结合蛋白、DNA pol，起始DNA解旋
        • 2||| 复制起点的激活（进入S期以后）
          • G1后期，Cyclin D↑--->CDK激活--->复制许可因子激活--->有丝分裂末期、核膜重组之前进入细胞核，结合DNA复制起点 复制启动后，复制许可因子被降解/失去活性
    • 2||| DNA链延长
      • 聚合酶转换（DNA pol ε、δ迅速替换α，以及δ、α之间的转换）频率高
      • DNA pol ε
        • PCNA作用下催化前导链合成
      • DNA pol δ
        • PCNA作用下催化后随链合成
      • DNA合成后立即组装成核小体（DNA复制与核小体装配同时进行）
    • 3||| 染色体末端复制
      • 端粒
        • 定义
          • 真核生物染色体线性DNA分子的末端结构，膨大呈粒状
        • 结构
          • DNA 3' 末端序列+蛋白质
          • 富含G、T，人重复序列：TTAGGG
        • 功能
          • 维持染色体稳定
          • 维持DNA复制完整性
      • 端粒酶
        • 本质
          • RNA-蛋白质复合体
        • 结构
          • 端粒酶RNA（hTR）
          • 端粒酶协同蛋白-1（hTP1）
          • 端粒酶逆转录酶（hTRT）
        • 功能
          • 以RNA为模板通过逆转录，对末端DNA链进行延长
        • 功能机制
          • 爬行模型P245
        • 病理
          • 老化与端粒酶活性下降有关
          • 肿瘤发生与端粒酶活性有关
    • 4||| 每个细胞周期中只复制一次
      • 复制仅出现S期，且只复制一次
    • 酶催化速率慢，但起点多，总体速率不慢 复制速度在不同组织器官、发育时期、生理状况下不同
  • 原核、真核生物DNA复制区别
    • 引物
      • 原核
        • RNA
      • 真核
        • RNA+DNA（需要RNA酶、核酸外切酶）
    • 速度
      • 原核
        • 培养条件相关
      • 真核
        • 速度慢、起点多，总体不慢
        • 组织器官、发育时期、生理状况相关
  • 真核生物mtDNA——D环复制
    • 复制起点不在双链DNA同一位点
    • 内环先复制，外环后复制（引物合成前后顺序不同）
• 逆转录
  • 准备
    • 原料
      • dNTP
    • 模板
      • 单链RNA
    • 引物
    • 酶
      • 逆转录酶（依赖RNA的DNA聚合酶）
        • 辅因子
          • 需要Zn2+
        • 合成方向
          • 5' --->3'
        • 特点
          • RNA指导的DNA聚合酶活性
          • DNA指导的DNA聚合酶活性
          • RNA酶（RNase H）活性
  • 过程
    • dNTP聚合，形成RNA/DNA杂化双链
    • 逆转录酶中具RNA酶活性的部分水解杂化双链中的RNA
  • 意义
    • 发展了中心法则
    • 基因操作制备cDNA
      • c：complementary
      • 试管内合成cDNA
        • 取得RNA，加入试管
        • 加入逆转录酶、dNTP
        • 加入Klenow片段
    • 加深了对RNA病毒致癌致病的认识

DNA损伤与修复

• DNA损伤因素
  • 体内因素
    • DNA复制错误
      • 4种dNTP之间浓度不平衡
      • 片段缺失/插入
    • DNA自身不稳定性
      • DNA受热/环境pH改变，碱基、核糖间糖苷键自发水解，导致碱基丢失/脱落，脱嘌呤最为显著
    • 机体代谢过程中产生的活性氧ROS
      • 直接作用修饰碱基
  • 体外因素
    • 物理因素
      • 电离辐射导致DNA损伤
        • 直接破坏DNA分子结构，如破坏化学键，使DNA断裂/交联
        • 激发自由基反应，氧化修饰碱基，剪接破坏碱基结构使其脱落
      • 紫外线照射导致DNA损伤
        • 相邻T共价连接形成胸腺嘧啶二聚体TT
    • 化学因素
      • 自由基导致DNA损伤
        • ·OH强氧化，·H强还原，损伤碱基、核糖、磷酸基
      • 碱基类似物导致DNA损伤
        • 碱基类似取代正常碱基掺入DNA，引发碱基对的置换
      • 碱基修饰剂、烷化剂导致DNA损伤
        • 修饰碱基，改变配对规则
        • 烷化剂烷基化碱基上N原子，导致DNA分子电荷变化，改变碱基配对
      • 嵌入性染料导致DNA损伤
        • 直接插入碱基对，碱基对距离增大一倍，DNA两链错位，复制时易发生核苷酸缺失、移码、插入
    • 生物因素
      • 黄曲霉素
• DNA损伤类型
  • 碱基损伤与糖基破坏
    • 亚硝酸——脱氨
    • 羟自由基——加成、脱氢
    • 氧化活性物质——氧化修饰碱基
  • 碱基之间发生错配
    • 碱基修饰剂、碱基类似物掺入
  • DNA链发生断裂
    • 戊糖破坏、碱基损伤和脱落
  • DNA链共价交联
    • 链内交联
    • 链间交联
  • 其他
    • 碱基置换
      • 转换
        • 嘌呤/嘧啶之间
      • 颠换
        • 嘌呤与嘧啶之间
    • 移码突变
    • 错义突变、无义突变
• DNA损伤修复
  • 直接修复
    • 嘧啶二聚体的直接修复/光复活修复（作用）
      • DNA光裂合酶（400nm激活）
        • 解聚嘧啶二聚体为单体核苷酸形式
    • 烷基化碱基的直接修复
      • 烷基转移酶
        • 转移烷基到自身，自身不可逆失活
    • 单链断裂的直接修复
      • DNA连接酶，连接电离辐射造成的切口
  • 切除修复
    • 碱基切除修复BER
      • 识别
        • DNA糖苷酶特异性识别受损碱基，水解去除
      • 切除
        • 5' 端，无碱基位点核酸内切酶切除磷酸二酯键，去除磷酸核糖部分
      • 合成
        • 缺口处，DNA聚合酶以另一条链为模板修补合成互补序列
      • 连接
        • DNA连接酶连接缺口，DNA结构恢复正常
    • 核苷酸切除修复NER
      • 还包括转录偶联修复，修复正在转录的基因模板链上的损伤（更有意义）
      • 识别
        • 识别损伤对DNA双螺旋结构造成的扭曲
      • 切除
        • 损伤部位两侧切开，去除切口间核苷酸
      • 合成
        • 汇合成一段新DNA
      • 连接
        • 连接缺口
      • 遗传性着色性干皮病XP
        • DNA损伤核苷酸切除修复系统基因缺陷
    • 碱基错配修复
  • 重组修复
    • 用于DNA双链断裂
    • 同源重组修复
      • 定义
        • 参加重组的两段双链DNA在相当长的范围内序列相同
      • 酶
        • RecA蛋白/重组酶
      • 特点
        • 重组生成新片段忠实性高
    • 非同源重组修复
      • 定义
        • 两段DNA链末端不需要同源性就能互相替代连接
      • 酶
        • DNA依赖的蛋白激酶（DNA-PK）
        • XRCC4
      • 特点
        • 忠实性不高
  • 跨越修复
    • 用于DNA双链大范围损伤
    • 重组跨越修复
      • 同源重组，直接跨越损伤部位，将损伤转移到子链
    • 合成跨越修复
      • DNA双链大片段、高频率损伤
      • 应急修复系统
      • 在大肠杆菌，复制中产生新的DNA pol IV/V替换III，随机插入核苷酸，越过损伤部位后离开烂摊子，DNA pol III继续接盘
        • 新产生的DNA pol活性低、识别碱基精确度差、无校对功能，故出错率增加
      • RecA和LexA阻遏物有关
• DNA损伤及其修复的意义
  • DNA损伤的双重效应
    • 基因突变的基础，给DNA带来永久性改变
    • 使DNA不能作为复制/转录的模板
  • 损伤修复障碍相关疾病