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第五章：抗体工程制药
全国普通高等医学院校药学类专业“十三五”规划教材《生物制药技术》抗体工程制药章节的总结整理，需要的自取。
编辑于2022-01-22 23:34:28- 抗体工程制药
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抗体工程制药
概述
概念
抗体工程制药（Antibody engineering pharmaceutics）
利用基因工程和蛋白质工程技术，对抗体基因进行加工改造和重新装配，或用细胞融合、化学修饰等方法改造抗体分子生产抗体药物的过程
抗体（Antibody，Ab）
高等脊椎动物的免疫系统受到外界抗原（Antigen）刺激后，由成熟的B淋巴细胞产生的能够与该抗原发生特异性结合的糖蛋白分子
抗体是机体免疫系统中最重要的效应分子，具有结合抗原、结合补体、中和毒素、介导细胞毒、促进吞噬等多种生物学功能，在抗感染、抗肿瘤、免疫调节和监视中发挥重要作用
发展历程
抗体作为疾病预防、诊断和治疗制剂已有上百年的历史，经历了从抗血清即 多克隆抗体 的使用，到应用 杂交瘤技术、基因工程抗体技术、抗体库技术进行抗体制备 ，并逐渐完善形成抗体工程，其发展历程大致可以分为三个阶段
多克隆抗体（Polyclonal antibody，pAb）

天然抗原中常含有多种不同抗原特异性的抗原表位，以该抗原刺激机体免疫系统，体内多个B细胞克隆被激活，产生的抗体实际上是针对多种不同抗原表位的抗体的混合物，即多克隆抗体，是第一代抗体
特异性不高、易发生交叉反应，也不易大量制备，因此这些抗体的临床应用有相当大的局限性
单克隆抗体（Monoclonal antibody，mAb）
1975 年德国学者 Köhler 和英国学者 Milstein 首次将小鼠骨髓瘤细胞和经过绵羊红细胞免疫的 小鼠脾 B 淋巴细胞 在体外进行两种细胞的融合，形成 杂交瘤细胞
该细胞既具有骨髓瘤细胞体外大量增殖的特性，又具有浆细胞合成和分泌特异性抗体的能力。其产生的均一性抗体识别一种抗原决定簇，即为 单克隆抗体 又称细胞工程抗体，第二代抗体
具有鼠源性，进入人体会引起机体的排异反应，产生人抗鼠抗体（human anti-mouse antibody，HAMA）反应
基因工程抗体（Genetically engineering antibody，gAb）

20世纪80年代初，在抗体基因的结构和功能的研究成果的基础上，利用重组DNA 技术将抗体基因进行加工、改造和重新装配，然后导入到适当受体细胞内表达，产生基因工程抗体即第二代单克隆抗体（更能与人相容的单克隆抗体或片段），是第三代抗体
保持了单抗的均一性、特异性强的优点，又能克服鼠源性抗体的不足
DNA 重组技术的发展，实现了部分或全人源化抗体的制备，如人-鼠嵌合抗体、改形抗体、小分子抗体、双特异性抗体及人源抗体等
1994 年 Winter 创建了噬菌体抗体库技术，这是抗体研究领域的又一次革命，它不用人工免疫动物和细胞融合，完全用DNA 重组技术制备完全人源化抗体
人源化轉基因小鼠技術 Transgenic animals
人源 B 細胞克隆技術 Human Single B Cell Cloning
单 B 细胞抗体制备技术
新一代快速制备 mAb 的技术 利用每个 B 细胞只产生一种特异性抗体的特性，直接从单个 B 细胞中扩增抗体基因，获得单个B 细胞所表达的抗原特异性抗体 具有高通量、高效率、低细胞数等优点，制备的抗体保留了丰富的基因多样性及轻重链可变区天然配对，是最新、最高效的抗体筛选方法之一 在快速应对病原微生物传染病的抗体开发上有着巨大优势。 
抗体结构与功能

抗体结构

由两条 H 链和两条 L 链共价结合而成
轻链包括VL和CL两个结构域，重链含有1个VH和3个CH结构域
VH和VL共同组成抗原结合部位
Ig分子中线对称，具有两个相同的抗原结合部位
抗体分子的多样性

对来自不同B细胞克隆的Ig轻链氨基酸序列进行比较，发现V区的变化主要集中在3 个分别由6-10个氨基酸残基组成的狭小区域内
这3个区又被称作高可变区或互补决定区（CDR），参与抗原结合部位的组成
互补决定区（Complementary determining region，CDR），它是V区中特异结合抗原的部位
 
框架区（Framework region，FR）维持 CDR 的空间构型
抗体分子的酶切片段

木瓜蛋白酶作用于IgG分子重链间二硫键的 N 端侧，将其裂解为 Fab 段和Fc 段
胃蛋白酶则切在该二硫键之 C 端侧，产生 F(ab’)2 和 pFc 段。
抗体分子的基本结构和各种分子片段

单抗制备
基本特性
 1975年 Köhler 和 Milstein 成功的将经过绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养的小鼠骨髓瘤细胞融合，使产生抗体的 B 淋巴细胞能在体外长期存活，并通过克隆化技术，建立单克隆的杂交瘤细胞株，该细胞株可以持续分泌均质纯净的高特异性抗体
高纯度单一抗体，只与一个抗原决定簇反应
可重复性，能够提供完全一致的抗体制剂
可以通过杂交瘤细胞的大规模培养进行生产
基本原理

制备过程

抗原与动物免疫
要制备特定抗原的单克隆抗体，首先要制备用于免疫的适当抗原再用抗原进行动物免疫
采用与骨髓瘤供体同一品系的动物进行免疫，BALB/c 小鼠和 Lou 大鼠
免疫方案应根据抗原的特性不同而定
将抗原与佐剂等量混合，制成乳剂，采用腹腔注射和皮下注射等方法进行免疫
细胞融合与杂交瘤细胞的选择
脾细胞：HGPRT+
骨髓瘤细胞：次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷型（HGPRT-）
饲养细胞（feeder cells）：小鼠腹腔巨噬细胞、脾细胞和胸腺细胞
细胞融合：聚乙二醇（PEG）诱导细胞融合，浓度为40%~50%，相对分子质量以4000为佳

HAT培养基选择杂交瘤细胞

HAT选择性培养基：基本培养基中加次黄嘌呤（hypoxanthine，H），氨基喋呤（aminoopterin，A）及胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）
核苷酸的合成途径有两条

从头合成途径（de novo synthesis pathway）
被叶酸拮抗剂氨基喋呤阻断
补救合成途径（salvage synthesis pathway）
即利用培养基中次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷合成核苷酸，这一途径需要次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（ HGPRT）或胸腺嘧啶核苷激酶（TK）
筛选阳性克隆与克隆化
在 HAT 培养液中生长形成的杂交瘤细胞仅少数可以分泌预定的单抗，且多数培养孔中混有多个克隆。 由于分泌抗体的杂交瘤细胞比不分泌抗体的杂交瘤细胞生长慢，长期混合培养会使分泌抗体的细胞被不分泌抗体的细胞淘汰。因此，必须尽快筛选阳性克隆，并进行克隆化 
筛选阳性克隆
酶联免疫吸附实验（ELISA）
放射免疫测定（RIA）
荧光激活细胞分选仪（FACS）
间接免疫荧光法（IFA）
杂交瘤细胞的克隆化
将抗体阳性孔的细胞进行分离获得产生所需单抗的杂交瘤细胞株的过程，是确保杂交瘤所分泌的抗体具有单克隆性以及从细胞群中筛选出具有稳定表型的关键一步 
有限稀释法
从具有阳性分泌孔收集细胞，经逐步稀释，使每孔只有一个细胞
软琼脂平板法
含有饲养细胞的0.5%琼脂液作为基底层，将含有不同数量的细胞悬液与0.5%琼脂液混合后立即倾注于琼脂基底层上，凝固，孵育7~10日后，挑选单个细胞克隆
杂交瘤细胞的冻存
细胞冻存液：50%小牛血清；40%培养液；10%DMSO
-70℃超低温冰箱，液氮
冻存细胞要定期复苏，检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性，在液氮中细胞可保存数年或更长时间
杂交瘤细胞抗体性状的鉴定
杂交瘤细胞的鉴定：染色体分析
抗体特异性鉴定：ELISA、IFA
单抗的Ig类与亚类的鉴定
单抗中和活性的鉴定：细胞或动物保护性实验即生物学活性
单抗识别抗原表位的鉴定：竞争结合实验
单抗亲和力的鉴定
单克隆抗体的大量制备
体内培养法

将杂交瘤细胞接种于小鼠或大鼠的腹腔内生长并分泌单克隆抗体
体外培养法
小规模生产采用滚瓶或转瓶，大规模采用生物反应器
单克隆抗体的纯化

用于体外诊断的单抗可采用硫酸铵沉淀后经亲和层析或凝胶过滤等纯化
体内诊断或治疗用单抗，必须除去内毒素、核酸、病毒等微量污染成分，再经盐析、超滤及合适的层析技术进行纯化，鉴定分析合格后供制剂用
基因工程抗体及其制备
概述
在临床治疗领域中使用鼠源单克隆抗体的主要障碍之一是产生人抗鼠抗体反应。因此对于疗程长、需反复多次给药的抗体药物，人源化是其重要的发展方向，以降低 HAMA反应
另外单抗的生产在技术上难以克服融合率低、建株难、不稳定、产率低的问题
FDA仅仅批准了3个鼠源单克隆抗体，第一个抗体药物Ortholone（肝移植排斥）就因其鼠源性于 2010 年退出市场
基因工程抗体
又称重组抗体，是指利用重组DNA及蛋白质工程技术对编码抗体的基因按不同需求进行加工和重新装配，经转染适当的受体细胞所表达的抗体分子
特点
降低抗体的免疫原性，消除人抗鼠抗体反应
分子量一般较小，穿透力强，更易到达病灶的核心部位
根据治疗的需要，制备多种用途的新型抗体
可以采用原核、真核表达系统以及转基因动植物生产大量的基因工程抗体，降低生产成本
分类
大分子抗体（嵌合抗体、重构抗体）
人-鼠嵌合抗体

嵌合抗体（chimeric antibody）是用人抗体的C区替代鼠的C区，使鼠源性单抗的免疫原性明显减弱，并可延长其在体内的半衰期及改善药物的动力学，属第一代人源化抗体（humanized antibody，HAb）

制备流程

提取杂交瘤细胞系的mRNA，逆转录成cDNA
以其为模板，PCR分别扩增VL和VH基因
分别连接真核表达所需的上游启动子、前导肽序列和下游剪切信号、增强子真核调控序列
将VL基因克隆到人Ig的CL基因表达载体上，将VH基因克隆到人Ig的CH基因真核表达载体上
再将人-鼠嵌合的L链和H链基因重组质粒共转宿主细胞，经筛选共转染细胞，所分泌的抗体为嵌合抗体
特点
对人体的免疫原性较亲本单抗大大减小，半衰期较鼠源单抗长
可根据不同的需要选择不同亚类的人恒定区基因
可对恒定区中个别氨基酸的点突变来改善抗体的生物学功能
由于嵌合抗体可变区仍保留鼠源性序列（~ 30%），可引起不同程度的HAMA，而且对肿瘤组织的穿透能力较差
1997年FDA批准上市的人源化单抗rituxan（美罗华）是一个抗CD20的人鼠嵌合型单抗，在非霍奇金恶性淋巴瘤患者的治疗中取得了良好的疗效
重构抗体

重构抗体（reshaped antibody，RAb）亦叫“改型抗体”，因其主要涉及CDR的“移植”，又可称为“ CDR 移植抗体（CDR grafting antibody）”。它是利用基因工程技术，将人抗体可变区（V）中互补性决定簇（CDR）的氨基酸序列改换成鼠源单抗CDR序列，此种抗体既具有鼠单抗的特异性又保持了人抗体的功能
重构抗体属第二代人源化抗体
仅有9%的序列来源于亲本鼠单抗，与嵌合抗体比较具有更低的免疫原性
构建重构抗体的4种策略
 框架区（FR）区不仅提供了CDR的空间构象环境，有时还参加抗体结合位点正确构象的形成，甚至参加与抗原的结合。简单的CDR移植往往导致抗体亲和力的降低或丧失
模板替换
使用与鼠对应部分有较大同源性的人FR替换鼠FR，使鼠CDR在替换后有类似的折叠环境，从而保持原来的构象（序列比较与分子建模）
表面重塑
对鼠CDR及FR表面残基进行修饰或重塑，使之类似于人抗体CDR的轮廓或人FR的形式
尽管鼠和人的可变区来自不同种属，但暴露于表面的氨基酸残基的位置和数目却非常保守，它们是可变区免疫原性的主要来源，将鼠可变区中暴露在表面的骨架区残基替换为人源性残基
补偿变换
在人FR中，通过对与CDR有相互作用、与抗体亲和力密切相关或与FR空间折叠起关键作用的残基的改变，来补偿完全的CDR移植
以抗体晶体数据和三维结构为基础
定位保留
保留鼠源单抗中参与抗原结合的CDR和FR中的一些关键残基，其余残基进行人源化
小分子抗体（Fab、ScFv）
利用基因工程技术构建分子质量较小的、能与抗原结合的分子片段，称为小分子抗体
优点
可进行原核表达
易于穿过血管壁或者组织屏障
无Fc段，减少Fc受体带来的影响
易于进行基因工程改造
分类
Fab抗体

Fab片段抗体由重链可变区（VH区）及第一恒定区（CH1区）与整个轻链以二硫键形式连接而成，主要发挥抗体的抗原结合功能
如果其中的恒定区CH1与L链的C区是人源的，则成为重组Fab或嵌合Fab抗体（chimeric Fab，cFab）
特点
不含Fc段、分子质量小、结合力高、抗原性低
易于穿透血管壁和组织屏障进入病灶
可作为载体分子偶联多种活性蛋白如酶、毒素等用于肿瘤等疾病导向性诊断和治疗
阿昔单抗（abciximab，ReoPro），该产品以血小板糖蛋白Ⅱb／Ⅲa为靶点，用以防止血小板聚集及血栓形成，作为冠状动脉导管插术时预防心肌缺血的辅助用药 兰尼单抗(lucentis)、赛妥珠单抗(cimzia)

scFv
scFv（single chain Fv，单链抗体）是由VH和VL通过一条连接肽（linker）首尾连接在一起，通过正确的折叠，VH和VL以非共价键形式结合形成具有抗原结合能力的Fv，大小约为完整单抗的1/6
具有分子小，穿透力强，廓清快，异源性低，易于大量生产等优点，故其在靶向载体，构建其他工程抗体（如多价小分子抗体）和细胞内抗体等方面具有乐观的应用前景
双（多）价抗体及双特异性抗体
双（多）价抗体
体外交联构建双价抗体
Fab或ScFv的羧基端设计Cys残基，通过形成二硫键交联成为双价抗体分子
通过自聚化结构域构建双或多价抗体

自聚化：将具有自聚化倾向的结构域（亮氨酸拉链、α 螺旋束、免疫球蛋白功能区CH3和链亲和素）连接在单价小分子抗体的3端，从而促使抗体分子片段多聚化
将CH3连接于scFv的羧基端，表达的融合蛋白可在胞内自动二聚化成二聚体，称为minibody
 Minibody
双链（diabody）及三链抗体（triabody）

通过基因改造缩短scFv的linker，使得两个不同的scFv配对，以非共价键结合成二聚体，称为双链抗体。通过引入链间二硫键，以稳定双链抗体结构
缩短接头不仅可以形成双链抗体，还可以形成三链甚至四链抗体分子
四价、二价和单价分子的功能亲和力比值约为140:20:1
双特异性抗体（Bispecific antibody，BsAb）

是由两个不同的抗原结合位点组成，即同一抗体的两个抗原结合部位分别针对两个不同的抗原，在结构上是双价的，但与抗原结合的功能是单价的
其中的一个抗原结合位点可与靶细胞表面抗原结合，另一个与效应物（如效应细胞、药物等）结合，从而将效应物直接导向靶细胞
化学交联法、杂交瘤细胞系融合法、基因重组
Catumaxomab（卡妥索单抗，2009年上市）能够同时靶向表皮细胞黏附因子（EPCAM）和T细胞上的CD3分子，前者是一个重要的肿瘤标志物，因此能将 T 细胞募集至肿瘤组织周围，用于EPCAM阳性的恶性腹水、卵巢癌、胃癌的治疗

抗体融合蛋白（antibody fusion protein）
是指将抗体分子片段与功能性的蛋白融合，从而获得具有多种生物学功能的融合蛋白
Fv抗体融合蛋白
利用Fv段的特异性识别功能将功能性蛋白靶向到特定部位
免疫靶向
将毒素、酶、细胞因子等生物活性物质与抗体融合，从而将这些生物活性物质靶向到特定的部位，有利于其生物学功能的发挥，并且减低其毒副作用
分类
免疫毒素

将针对肿瘤细胞特异表达的膜分子的抗体与毒性蛋白融合称为免疫毒素，常用的有细菌来源的毒素，如绿脓杆菌外毒素、白喉毒素和植物来源的毒素，如蓖麻毒素、皂草素等
免疫细胞因子

将抗体片段与细胞因子融合，可将这些细胞因子靶向到肿瘤部位而发挥抗肿瘤作用，同时减少全身毒副作用，这类融合蛋白称为免疫细胞因子
目前与抗体融合的细胞因子有IL-2、IL-12、TNF及GM-CSF等
人白介素-2（rhIL-2）
治疗肾细胞癌、黑色素癌
副作用：全身性毛细血管渗漏综合征vascular leak syndrome（VLS）
解决办法

与蛋白酶融合
与超抗原连接
免疫桥连
抗体分子与另一特异性靶向分子融合，构建可以同时结合效应细胞和靶细胞的融合蛋白，从而达到免疫治疗的目的
将抗CD3的抗体与表皮生长因子（EGF）基因进行拼接形成融合蛋白，可将表达有CD3的T细胞与带有EGF受体的肿瘤细胞连接起来，介导T细胞杀伤效应
嵌合受体

将抗体的抗原识别部分与特定细胞膜表面蛋白分子融合，形成的融合蛋白表达于细胞表面，该融合蛋白既可利用抗体部分结合抗原，又可以通过膜蛋白部分传导信号至细胞内，引起细胞活化，产生特定的生物学效应
如T细胞表面表达嵌合抗体（T body）通过其表面的嵌合抗体与肿瘤细胞结合，从而激活T细胞杀伤肿瘤细胞或释放淋巴因子
Fc抗体融合蛋白
利用Fc段所特有生物学功能与某些具有黏附或结合功能的蛋白融合，所获得的融合蛋白称为免疫黏附素（immunoadhesin）
功能包括
增加融合蛋白在血液中的半衰期，使蛋白类药物长效化
将Fc的生物学效应如ADCC、激活补体及调理作用等靶向到特定的目标
用于融合蛋白的纯化和检测等
Etanercept，益赛普，是一种融合蛋白，一段是TNFα受体，一段是人IgG1的Fc端，治疗类风湿关节炎、强直性脊柱炎

纳米抗体

1993 年在骆驼血中发现，天然缺失轻链和重链恒定区1（CH1），只由一个重链可变区组成的单域抗体VHH（variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody），由于其晶体结构呈椭圆形，直径2.5nm，长4nm，所以又称为纳米抗体（nanobody, Nb）
相对分子质量为15kDa，为普通抗体的十几分之一，这使它比普通的抗体分子更容易接近靶目标表面的裂缝或者被隐藏的抗原表位，所以它可以识别很多普通抗体所不能识别的抗原
纳米抗体结构简单、溶解性好、稳定性高且与抗原亲和力强，可以利用基因工程技术和抗体库技术对其进行改造，转变为多种形式、有特殊功能的分子用于疾病的诊断和治疗
分类
单价纳米抗体
多价和多特异性纳米抗体
“融合”纳米抗体
特点
有完整功能的最小的抗原结合片段
具有高度水溶性和构象稳定性
能识别独特的抗原表位
能有效地穿过血脑屏障
抗体库技术（antibody library）
概述
利用基因克隆技术克隆全套抗体可变区基因，然后重组到特定的表达载体，再转化宿主菌（细胞）以表达有功能的抗体分子片段，并通过亲和筛选获得特异性抗体可变区的技术
利用抗体库技术筛选到的抗体基因用于构建和表达基因工程抗体
分类
噬菌体抗体库（phage display antibody library techniques）
概述
丝状噬菌体展示技术（phage display technology）与抗体组合文库技术（combinatorial immunoglobulin library technology）相结合而产生
该技术的出现开创了一条简便快捷的基因工程抗体生产路线，为人源抗体的制备提供了新途径，可视为抗体工程史的里程碑
基本原理

以噬菌体为载体，将抗体基因与噬菌体编码外壳蛋白（cpⅢ）或（cpⅧ）的基因相连，在噬菌体表面以抗体-外壳蛋白融合蛋白的形式表达（噬菌体表面展示）
采用PCR技术将B细胞全套可变区基因克隆出来，通过上述噬菌体表面展示技术组装成噬菌体抗体的群体，则成为噬菌体抗体库
技术特点
将表型（与抗原特异结合）和基因型（含有抗体基因片段）统一，使识别抗原的能力与进行再扩增的能力结合在一起
可绕过免疫直接制备全人源性抗体，使单克隆抗体的制备变得简单易行，稳定有效
避免了鼠源性抗体在人体应用时诱发的HAMA等不良反应
噬菌体抗体库的构建及筛选
克隆出抗体全套可变区基因，与有关载体连接，导入受体菌系统，利用受体菌蛋白合成分泌等条件，将这些基因表达在噬菌体的表面，进行筛选与扩增，建立抗体库

步骤
抗体基因片段的扩增
提取B细胞的mRNA，经RT-PCR合成cDNA，然后以cDNA为模板扩增抗体重链和轻链可变区基因
抗体mRNA来源细胞有三种
杂交瘤细胞
抗体亲和力高、阳性率高，重、轻链属自然配对，但相应的库容量也小
免疫的脾淋巴细胞或骨髓中的浆细胞
构建的噬菌体抗体库特点与杂交瘤细胞的相似，但它的重、轻链属混配
未经免疫的B淋巴细胞
库容量大，但它筛出的抗体亲和力低，有交叉反应，具有典型的初次免疫应答特点
噬菌体抗体表达载体的构建
噬菌粒（phagemid）载体
以丝状噬菌体的复制起始点序列为基础组建，不存在组装噬菌体颗粒的遗传信息（包括启动子、核糖体结合位点、前导序列、供外源基因插入的多克隆位点，及丝状噬菌体M13的外壳蛋白基因等）
借助辅助噬菌体（helper phage）超感染，才能组装成完整的噬菌体颗粒，得到野生型与融合蛋白混合表达型的噬菌体
将获得的全套抗体重链基因与轻链基因以适当的内切酶消化后，克隆到载体中的相应酶切位点
抗体基因的表达
抗体分子以融合蛋白形式表达在噬菌体颗粒外膜上，相当于体内B细胞的膜型表达，这使我们能在体外模拟体内的抗原对特异性抗体的克隆选择过程
特异性抗体片段的筛选
固相纯化抗原法
 
将靶抗原包被在固相介质上
加入待筛选的噬菌体，靶抗原吸附噬菌体抗体
反复洗涤去除非亲和性或低亲和性的噬菌体
洗脱并收集与抗原特异性结合的噬菌体
再次感染大肠杆菌，使特异性的噬菌体扩增富集
噬菌体抗体库技术的优点
噬菌体抗体库技术已具备相当量的库容
噬菌体抗体库技术无需免疫动物，能够模拟天然抗体库
适于大规模工业化生产
抗体表型和基因型一致
通过噬菌体展示产生的六种治疗性抗体

噬菌体抗体库技术作为后基因组时代一个强有力的实验技术，具有高效、经济、快捷等优势，但该技术在亲和性、库容量及多样性还有很多方面有待改进。因此研制出超大容量的和高亲和力的抗体库以及优化亲和筛选方法势在必行
核糖体展示技术

核糖体展示（ribosome display）技术是在多肽多聚核糖体展示（poly ribosome display）技术的基础上建立的一种完全离体进行的功能蛋白筛选和鉴定新技术，是一种完全在体外筛选和呈现功能蛋白的方法
将正确折叠的蛋白质及其mRNA同时结合在核糖体上，形成靶蛋白-核糖体-mRNA三元复合物，将基因型与表型直接偶联起来，并利用mRNA的可复制性，使靶基因（蛋白）得到有效富集的一项技术
特点
完全在体外进行
有建库简单、库容量大、筛选方法简单、无需选择压力且不受转化效率限制等优点
还可以通过引入突变和重组技术来提高靶蛋白的亲和力，因此它是构建大型文库和获取分子的有力工具
抗体发现方法