ELISA

ELISA知识总结，包括免疫标记技术的概念、分析、常用标记物、分类、应用，酶联免疫吸附试验方法介绍。

ELISA

• 免疫标记技术
  • 概念
    • 用标记物标记已知抗原（或抗体）进行的抗原抗体反应
    • 通过检测标记物间接的反映抗原抗体反应的情况，从而检测出被检抗原或抗体的存在与否或量的多少
  • 分析
    • 免疫技术：抗原抗体反应（高度特异性）
    • 标记技术：示踪物质标记（高度灵敏性）
  • 常用标记物
    • 荧光素：FITC、TRITC、RB200、镧系元素螯合物 免疫组化、免疫分析测定
    • 放射性核素：3H、14C、32p、57Gr、125I、131I 免疫分析测定
    • 酶：HRP（辣根过氧化物酶）、AP（碱性磷酸酶） 免疫组化，免疫分析测定
    • 化学发光物：Luminol、lucigenin 免疫分析测定
    • 金属颗粒：胶体金，铁蛋白 免疫组化，免疫分析测定
  • 分类
    • 按检测目标分类
      • 固相样本 免疫组化
      • 液相样本 免疫测定
    • 按标记物分类
      • 酶免疫技术
      • 荧光免疫技术
      • 放射免疫技术
      • 其他免疫技术
  • 应用
    • 对微量的抗原（或抗体）进行定性、定量及定位检测
• 酶联免疫吸附试验
  • 直接法
  • 间接法
  • 夹心法
    • 分类
      • 双抗原夹心法
      • 双抗体夹心法
        • 原理：已知抗体-待检抗原-已知酶标记抗体-底物
        • 用途：检测抗原（大分子抗原）
    • 实验目的
      • 掌握酶联免疫吸附试验间接法的原理、方法、结果判定及临床应用
      • 掌握酶标仪的正确使用方法
      • 熟悉酶联免疫吸附试验的分类、原理及主要应用
    • 实验原理
    • 实验材料
      • 抗原:新冠病毒N蛋白
      • 包被液:0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH9.6
      • 封闭液:BSA(小牛血清白蛋白)，pH7.4
      • 一抗:新冠病毒抗N蛋白标准品、待检血清
      • 样本稀释液:PBS，pH7.4
      • 酶标二抗:辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗人lgG
      • 底物溶液:TMB(四甲基联苯胺)溶液(A液+B液)
      • 洗涤液:Tris-HCL tween-20，pH7.4
      • 酶促反应终止液:2mol/L H2SO4溶液
    • 实验器材
      • 聚苯乙烯微量酶标反应板96
      • 酶标测定仪
      • 微量移液器
      • 37℃温箱等
    • 实验步骤
      • 包被抗原:用包被液将抗原作适当稀释(10μg/mL)，加入96孔酶标反应板中，100μL/孔，4℃放置过夜 洗涤：倒尽板孔中液体，加洗涤液200uL/孔，轻摇半分钟，反复三次，每次将反应板倒置在吸水纸上，将孔中洗涤液拍干
      • 封闭:200μL/孔，37℃孵育1小时或4℃过夜 洗涤三次
      • 加入一抗:将新冠病毒抗N蛋白抗体标准品倍比稀释后(阳性对照)和待检血清作为一抗分别加入酶标反应板孔中，100uL/孔，37℃孵育0.5小时。同时用PBS做空白对照 洗涤三次
      • 加入HRP-羊抗人lgG(二抗):将稀释的HRP-羊抗人lgG加入酶标反应板，100μL/孔，37℃孵育0.5小时 洗涤六次
      • 加入底物:每孔中先后加入TMB反应液A50μL和TMB反应液B50uL，室温放置显色
      • 终止反应:加入酶促反应终止液，50uL/孔，终止反应
    • 实验结果
      • 用酶标仪在450nm处测定各孔吸光度。用阳性对照各孔一抗浓度作为横坐标，阳性对照各孔吸光值作为纵坐标绘制标准曲线，最后利用标准曲线测得待检血清中抗体的浓度
    • 注意事项
      • 加样时应加到板孔的底部，避免加至孔壁上部，并注意不能溅出或产生气泡
      • 温育时板上应加盖或膜以防液体蒸发
      • 洗涤是决定实验成败关键的步骤，一定严格按要求洗涤。洗板时孔内液体拍得越干净洗涤效果更好
      • 止显色反应后，应在10分钟内测定A450nm
  • 竞争法
  • 捕获法