GST亲和层析

GST亲和层析实验介绍，包括实验目的、实验原理、基本元素、实验试剂、实验器材、实验步骤等。

GST亲和层析

• 实验目的
  • 理解并掌握亲和层析的基本原理和实验方法
  • 了解亲和层析技术的应用
• 实验原理
  • 将具有亲和力的两个分子中的一方固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化
  • 用途：分离含量低且生物活性不稳定的化学物质
• 基本元素
  • 固定相——亲合吸附剂
    • 载体：交联琼脂糖凝胶颗粒
    • 配基：GSH（谷胱甘肽）（与GST之间有特异性亲和力）
  • 流动相：含有预分离物质的混合液
    • 细菌总蛋白提取液（含GST标签蛋白）
    • 洗涤缓冲液
    • GSH洗脱缓冲液
• 实验试剂
  • R:GST-tag Purification Resin
  • L:裂解缓冲液
  • E:溶菌酶
  • G:洗脱缓冲液(含GSH)
  • 医用消毒酒精、蒸馏水
  • W:洗涤缓冲液
• 实验器材
  • 耗材:冰盒、1.5mL离心管、一次性吸头、有菌废物缸
  • 仪器:试管架、微量移液器、涡旋震荡器、冰箱、低温高速离心机;水浴锅
  • 材料
    • IPTG诱导GST标签蛋白菌液
    • IPTG未诱导GST标签蛋白菌液
• 实验步骤
  • 细胞总蛋白提取
    • 取IPTG诱导表达GST标签蛋白的菌液(IPTG未诱导菌液做对照)1mL至1.5mL 离心管中，4℃15000g离心1min，弃上清，收集沉淀(重复一次)。
    • 加入150μL裂解缓冲液(L)，将细菌沉淀充分重悬于裂解缓冲液中，(可进行轻微的 vortex，尽量避免产生气泡)。
    • 每管加入溶菌酶(E)3μL，轻轻混匀(手指轻弹)，尽量避免产生气泡，置于冰上放置30min。轻轻vortex数下，以充分裂解细菌，尽量避免产生气泡。
    • 4℃15000g 离心10min，各收集50uL做后续检测用(收1)，收集余下上清至一新的洁净离心管中(收2，约100uL)
  • GST标签蛋白亲和层析纯化
    • 向“收2”管中加入20μL混合均匀的GST-Tag Purification Resin(R)，置于4℃冰柜中30min期间将管内沉淀的凝胶颗粒轻弹重悬混匀5次(以充分结合含GST标签的目的蛋白)
    • 4℃离心1000gx10s沉淀凝胶，弃上清
    • 加入100μL洗涤缓冲液(W)重悬凝胶，4℃离心1000gx10s，弃上清。 不情 ⑦ 8.重复步骤7，再进行一次洗涤
    • 加入20uL洗脱缓冲液(G)，轻轻重悬凝胶。4℃离心1000gx10s，收集上清到新EP管。(上清内即为纯化获得的目的蛋白)
    • 重复步骤9一次，共洗脱并收集约40uL纯化的蛋白样品。