核酸杂交技术

第四章核酸杂交技术知识梳理，包括它的基本原理、核酸分子杂交的概念、经典的核酸分子杂交技术、DNA芯片技术等等。

核酸杂交技术

• 基本原理
  • 维持双螺旋稳定的因素
    • 横向——氢键
    • 纵向——碱基间的堆积力
  • 在260nm波长有最大吸收峰，是碱基的共轭双键决定的
    • 核酸定量的依据
• 核酸分子杂交的概念
  • 概念
    • 变性
      • 在物理和化学因素的作用下，维系核酸二级结构的氢键和碱基堆积力受到破坏，DNA 由双链解旋为单链的过程
    • 核酸分子杂交
      • 具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基配对原则形成双链的过程
        • DNA-DNA
        • DNA-RNA
        • RNA-RNA
  • 核酸探针
    • 指与靶核酸序列发生碱基互补杂交，并由其标记而被特异性检测的核酸分子
    • 种类
      • DNA探针
        • 长度一般为400-500个碱基
      • RNA探针
      • 寡核苷酸探针
        • 含有较少碱基的短链核苷酸的总称
        • 优点
          • 可根据需要合成相应序列，包括仅一个碱基差别的靶序列
          • 探针短，序列复杂性低，分子量小，因此杂交时间短
          • 长度一般17-50bp，该识别序列内1个碱基的变化可降低杂交 DNA 解链温度（ Tm 值）
          • 可大量合成，价格低，能够进行非放射性标记
        • 缺点
          • 稳定性较弱，需要优化杂交和洗脱条件
        • 合成时的原则
          • 根据已知核酸序列设计探针，并确定探针序列在靶序列中是唯一的
          • 一般长度（17-50bp)
          • G 碱基含量不能过高
          • 避免探针序列中存在自身互补结构
          • 避免同一碱基连续出现，避免探针中含有重复的序列（如 Alu 序列）
          • 应合成两种不同序列的探针，一种和靶序列完全互补，另一种和靶序列有错配，用 于检测突变位点；并尽量使错配的碱基位于探针的中央
    • 核酸探针的标记
      • 为确定探针是否与相应基因组 DNA 杂交，有必要对探针加以标记，以便在结合部位获得可识别的信号
      • 标记的种类
        • 放射性标记
          • 32P、35S、3H（氚）等标记探针
        • 非放射性标记
          • 生物素、地高辛、荧光素等
        • 后者不及前者敏感，但后者保存时间较长，无同位素污染
      • DNA聚合酶
        • 是细胞复制 DNA 的重要作用酶，以 DNA 为复制模板，聚合酶活性，主要活性是催化 DNA 的合成（在具备模板、引物、 dNTP 等的情况下）
      • 探针标记方法的选择
        • 随机引物标记
          • DNA 样品经过变性与人工合成的随机引物随机互补结合，在标记的 dNTP 存在的条件下， DNA 聚合酶I的 Klenow 片段通过不断在引物 DNA 的3'-0H端添加标记的单核苷酸，催化引物延伸，并产生有标记的产物
        • DNA缺口平移标记
        • 全程RNA探针标记
        • 化学法全程标记
        • 末端标记（3’末端标记、5‘末端标记）
  • 分子杂交信号检测
    • 放射性标记探针检测
      • 放射自显影
        • 探针标记放射性核素，如32P、35S
        • 将带有探针的杂交膜与 X 线胶片在暗盒中曝光数小时或数天（视放射性强弱而定）后，将 X 线胶片显影、定影即可
    • 非放射性标记探针的杂交检测
      • 常用标记物
        • 生物素（维生素，结合亲和素）
        • 地高辛（半抗原，结合相应特异性抗体）
      • 分类
        • 酶促显色检测：酶直接作用于显色或化学发光底物，产生颜色沉淀或发光
        • 荧光检测：荧光素在激发光下发射出荧光，其标记探针可通过荧光显微镜等观察检出
        • 化学发光检测：酶底物在被酶水解时会发光，从而形成检测信号，发光射线强度反应酶活性
        • 多探针检测/联合检测：每种探针分别用不同报告基团标记并同时与固定在薄膜上的核酸分子杂交
• 经典的核酸分子杂交技术
  • 概念
    • 共生
      • 基本原理与步骤基本相同，仅选用杂交原材料、点样方法不同
    • 固体支持物
      • 硝酸纤维素膜、尼龙膜、磁珠和微孔板等
  • 选择原则
    • 具有较强的结合核酸的能力
    • 与核酸的结合比较稳定
    • 尽量少的非特异性吸附
  • 分类
    • 固相杂交
      • 先将参加反应的一条核酸链先固定在固体支持物上，另一条反应核酸游离在溶液中。由于固相杂交后，未杂交的游离片段可容易地漂洗除去，膜上留下的杂交物容易检测和能防止靶 DNA 自我复性等优点，所以最为常用
      • 反向点杂交（ROD）
        • 原理
          • 1．将待用的探针分别点到硝酸纤维素膜或尼龙膜上，每个探针一个点并编上号；2．再将待测的 DNA 样本（经 PCR 特意性扩增，在 PCR 引物5'端预先进行生物素标记，使扩增产物相应标记有生物素）与之杂交； 3．经洗涤，再经相应的显色反应就能显出杂交信号
        • 应用
          • 一次实验可以判断某一基因座位的大部分或全部等位基因
          • 用于基因分型、病原体检测等研究
      • Southern印迹杂交
        • 检测对象为DNA
        • 原理（电转移原理）
          • 1.将尼龙膜与凝胶贴在一起，并将凝胶与尼龙膜一起置于滤纸之间，固定；2.置于盛有转移电泳缓冲液的转移电泳槽中，凝胶平面与电场方向垂直，附有滤膜的一面朝向正极；3.在电场的作用下，凝胶中的 DNA 片段沿与凝胶平面垂直的方向泳动，从凝胶中移出，滞留在滤膜上，形成印迹
        • 应用
          • 单基因遗传病的诊断
            • 镰状细胞贫血
          • 基因点突变检测
      • Northern印迹杂交
        • 检测对象为RNA
        • 原理
          • 是一种将 RNA 从琼脂糖凝胶中转印到固相支持物上的方法
        • 应用
          • RNA病毒的检测
          • 基因表达的检测
      • 菌落杂交
      • 斑点/狭缝杂交（被检标本直接点样到膜上）
    • 液相杂交
      • 待测核酸和探针都存在于杂交液中，探针与待测核酸在液体环境中按照碱基互补配对形成杂交分子的过程
      • 特点
        • 不需要支持物
      • 缺点
        • 杂交后过量的未杂交探针在溶液中除去较为困难和误差较高，存在于杂交后溶液中，检测结果有误差
    • 原位杂交
      • 将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交
        • 使用 DNA 或者 RNA 探针来检测与其互补的另一条链在细菌或其他真核细胞中的位置
      • 优点
        • 环境污染降低，灵敏度高，可进行多重染色等特点，缩短实验周期
      • 应用
        • 观察基因在组织中的表达
        • 确定基因在染色体中的定位
      • 荧光原位杂交步骤
• DNA芯片技术
  • 概念
    • DNA芯片
      • 指将大量已知序列的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有序地、高密度地固定于支持物／固相载体材料（如：玻璃片或纤维膜）上，然后与荧光标记的待测生物样品中的靶核酸分子进行杂交，通过检测分析杂交信号的强度及分布，对基因序列及功能进行大规模、高通量的研究
      • 特点：同时、快速、准确、大规模、高通量
      • 应用：基因表达检测、寻找新基因、杂交测序、基因突变
• 影响杂交信号检测的因素
  • 探针的选择
  • 探针的标记方法
  • 探针的范围
  • 杂交率
  • 杂交温度
  • 杂交的严谨性
  • 杂交反应时间
  • 杂交促进剂