第八章 荧光免疫试验

第八章 荧光免疫试验的思维导图， 荧光免疫试验是以荧光物质标记抗体和抗原，通过与相应抗原或抗体发生特异性结合反应，以此对待测物进行定位、定性和定量分析的检测技术。

第八章 荧光免疫试验

• 定义
  • 以荧光物质标记抗体和抗原，通过与相应抗原或抗体发生特异性结合反应，以此对待测物进行定位、定性和定量分析的检测技术。具有高度特异性、敏感性和直观性，是最早出现的免疫标记技术
• 组成要素
  • 基础知识
    • 荧光
      • 荧光物质吸收激发光的能量后，电子从基态跃迁至激发态，当其回复至基态时，以发射光形式释放出能量
      • 特点
        • 可产生荧光的分子或原子在接受能量后即刻引起发光
        • 一旦停止功能，荧光随之瞬间消失
    • 荧光光谱
      • 发射光谱
        • 固定激发光波长，在不同波长下记录到的标本发射荧光的谱图
      • 激发光谱
        • 固定检测发射光波长，用不同波长的激发光照射标品得到的荧光的谱图
    • 荧光效率
      • 由荧光色素本身的物理性质决定
      • 荧光物质将吸收的光能转化成荧光的百分率
    • 荧光寿命
      • 荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程度时所用的时间
      • 各种荧光物质的荧光寿命不同
    • 荧光淬灭
      • 荧光物质在某些理化因素作用下，发射荧光减弱甚至消退
      • 例子
        • 紫外线照射、高温（≥20℃）、苯胺、酚、硝基苯
      • 避免措施
        • 避免长时间照射
        • 脉冲瞬间照射
        • 避光保存
      • 淬灭剂
        • 具有荧光淬灭作用的物质
    • 荧光物质
      • • 详见第四章思维导图
  • 荧光显微镜（自学）
    • 原理
      • 利用一定波长的激发光对待测标本进行激发，产生一定波长的荧光，对组织细胞结构或其组分进行定性、定位和半定量分析检测
    • 组成
      • 光源
      • 滤光片
        • 隔热滤光片
          • 位置
            • 灯室聚光器前
          • 作用
            • 阻断红外线通过而隔热
        • 激发滤光片
          • 位置
            • 光源和物镜之间
          • 作用
            • 能选择性地透过紫外线可见波长的光域，提供合适的激发光
        • 吸收滤光片
          • 位置
            • 物镜和目镜之间
          • 作用
            • 阻断激发光而使发射的荧光透过，保护眼睛
      • 光路
        • 透射光
          • 照明光线从标本下经聚光器透过标本进入物镜
        • 落射光
          • 照明光线从标本上经垂直照明器落射到标本，经标本反射进入物镜
      • 聚光器
      • 镜头
  • 荧光素-抗体结合物
    • 关键
    • 抗体要求
      • 高特异性
      • 高亲和力
      • 经纯化提取IgG
    • 荧光素要求
      • 有能与蛋白质形成共价健的化学基团
      • 荧光效率高
      • 荧光色泽与背景组织的色泽对比度高
      • 与蛋白质结合后不影响蛋白质原有性质
      • 标记方法简单、安全无毒
      • 与蛋白质的结合物稳定，易于保存
• 间接免疫荧光试验
  • 原理
    • 特异性抗体与相应抗原反应，荧光素标记的抗抗体再与第一抗体结合
  • 优点
    • 敏感度高于直接法
    • 制备一种荧光抗体可检测多种抗原
    • 既可用于检测抗原，也可检测抗体
  • 缺点
    • 易出现非特异性荧光
    • 方法较麻烦
    • 操作时间较长
  • 应用
    • 自身抗体的检测
  • 实验方法
    • 标本上滴加特异性抗体 湿盒中37℃温浴30min PBS洗涤 滴加二抗 湿盒中37℃温浴30min PBS洗涤 镜检
  • 注意事项
    • 荧光染色时间
      • 一小时内或2~8℃保存4小时
    • 三种对照
      • 阳对：阳性血清＋荧光标记物
      • 阴对：阴性血清＋荧光标记物
      • 荧光标记物对照： PBS ＋荧光标记物
    • 标本片需保持湿润，避免干燥
    • 滴加抗体或荧光标记物，始终保持在未知抗原标本上
  • 结果分析
    • -
      • 无或仅见极微弱荧光
    • +
      • 荧光较弱但清楚可见
    • ++
      • 荧光明亮
    • +++
      • 耀眼强荧光
    • 阳性：特异荧光强度＋以上（对照光应呈﹣或土） 根据＋的血清最高稀释度判定特异性抗体效价
• 流式荧光免疫试验
  • 原理
    • 采用人工微球和流式检测方式对可溶性物质进行高通量分析的检测方法
  • 分类
    • 悬浮阵列
    • 流式微球阵列
• 其他
  • 时间分辨荧光免疫试验（TRFIA）
    • 原理
      • 时间分辨
        • 自发荧光寿命短：1ns~10ns
        • 镧系元素寿命长：10μs ~1000μs
        • 短寿命荧光完全衰变后再测定铺系元素特异荧光
      • stokes位移
        • 激发光谱和发射光谱的波长差
        • stokes 位移小，相互干扰，影响结果准确性
        • 镧系元素 Stokes 位移大(273nm)，激发光谱和发射光谱不重叠
      • 激发光谱和发射光谱
        • 发射光谱带较窄，干扰少
        • 激发光谱带较宽，灵敏度高
      • 荧光标记物的相对比活性
        • 比活性
          • 单位时间内每个标记分子可被探测到的信号量
            • Eu3＋螯合物反复激发1000次／秒大大提高了荧光标记物比活性
      • 信号增强
        • Eu3＋标记抗原抗体复合物
        • Eu3+解离
        • 荧光增强
    • 标记物
      • 镧系元素
        • Eu3+
    • 标记方法
      • 具有双功能基团的螯合物
        • 一步法
        • 二步法
        • 详见第四章
    • 方法类型
      • 双抗体夹心法
      • 固体抗体竞争法
      • 固体抗原竞争法
    • 方法学评价
      • 灵敏度高：最小检出量10·18mol/ L
      • 分析范围宽：4~5个数量级
      • 标记物稳定：有效使用期长
      • 测量快速，易自动化
      • 易受污染，本底增高
  • 荧光偏振免疫试验（FPIA）
    • 原理
      • 偏振光
        • 光线通过偏振滤光片后，形成一个方向的平面光
      • 抗原抗体竞争反应
        • AgF分子小，转动速度快，偏振荧光弱
        • AgF - Ab 分子大，转动速度慢，偏振荧光强
        • 若待检抗原多，则 AgF - Ab 少， AgF多，偏振荧光弱
        • 待检抗原含量与偏振荧光强度成反比
    • 方法学评价
      • 样品用量少
      • 荧光素标记试剂稳定，使用寿命长
      • 重复性好
      • 快速，易自动化
      • 适于小、中等分子物质检测
      • 灵敏度较非均相荧光免疫测定法低
  • 荧光酶免疫测定
• 临床应用
  • 间接免疫荧光试验
    • 血清中自身抗体检测
      • 详见书彩图P4-6
    • 各种微生物的快速检查和鉴定
    • 寄生虫感染的诊断
    • 白细胞分化抗原的检测
    • 人类白细胞抗原的检测
    • 肿瘤组织中肿瘤标志物的检测
    • 激素和酶的组织定位
  • 其他荧光免疫试验
    • 时间分辨荧光免疫试验
      • 内分泌学中的应用
      • 肿瘤学中的应用
      • 免疫学中的应用
      • 分子生物学的应用
      • 微生物学中的应用
    • 荧光偏振免疫试验
• 主要影响因素
  • 荧光素﹣抗体结合物
    • 抗体纯度
      • 高亲和力、单克隆抗体
    • 抗体特异性
      • 吸收试验
      • 抑制试验
    • 抗体效价
      • 双向免疫扩散（＞1：16理想）
    • 荧光素-抗体结合物的结合比率（F/P）
      • 标记抗体质量鉴定的重要指标
      • 荧光素结合到抗体蛋白上的量
      • F / P 值越高，说明抗体分子上结合的荧光素越多
  • 待检标本
    • 组织标本
      • 冷冻切片
      • 石蜡切片
      • 印片
    • 细胞标本
      • 涂片
      • 爬片
    • 细菌标本
      • 涂片
      • 爬片
  • 其他
    • 反应时间和温度
    • 荧光抗体的保存
      • 2-8℃：6个月
      • -20℃：2-3年
      • 真空干燥：长期保存